N-階段灌流細胞培養

在生產生物反應器中，即通常所指的N-階段生物反應器，細胞培養可在開始階段快速達到超過系統容量的生物質水平，但由于營養或設備限制，細胞活性會快速降低。為防止這一情況的發生，可通過控制細胞密度的方法，在更長的生產期內，維持生物質恒定。當同時考慮N-1和N階段時，可采用不同的策略，批次、補料分批和灌流模式可通過不同的方式而被改變。參考原文介紹了最近的一些關于在合理的更長時間的高密度灌流細胞培養中、使用不同的方法來控制并維持穩態的案例。

N-1和生產（N-階段）生物反應器不同操作策略的示意圖（A）N-1批次 & 生產生物反應器補料分批（B）N-1灌流 & 生產生物反應器高密度接種補料分批（C）N-1批次 & 生產階段開始灌流，以快速提高生物質，之后補料分批操作（D）N-1批次 & 生產生物反應器灌流，并控制細胞密度。箭頭指示在不同案例中使用灌流技術的優勢：可用于接種的更高的生物質、更短的生產時間（B）；生產階段更高的生物質（C）；生產階段更高的生物質以及更長的運行時間(J.Bielser，et al., 2018)。

半連續和連續廢棄分別根據每日離線細胞計數或在線生物質傳感器監測結果進行。每日廢棄會導致一種不連續的“鋸齒狀”行為，在兩個相鄰的廢棄點之間，細胞密度連續增加，而在廢棄點顯著下降，這種方法可以在沒有在線監測和控制使用。另一種替代方法是，根據細胞計數，每日調節連續廢棄，可獲得更加穩定的反應器行為，這種策略與半連續方法的區別在于連續的細胞去除，但細胞生產在某一時間點，還是會發生偏差。所以，最應選擇的方法是使用在線生物質傳感器，將其檢測值與廢棄流速直接耦連，以維持預先確定的設定值。

Dowd等使用聲學過濾器和0.05 - 0.4 nL/cell/day的CSPR，維持~50 x 10^6 cells/mL活細胞密度的穩態操作5天。Clincke等報導使用TFF，以~1.44VVD的灌流速率，達到20 - 35 x 10^6 cells/mL的活細胞密度。使用ATF，以4.5 - 5 vvd-1的灌流速率，維持90 - 130 x 10^6 cells/mL的活細胞密度2周。Karst等報導使用ATF和TFF，將活細胞密度維持在20、60和40 x 10^6 cells/mL，穩態操作10天，灌流速率在1.06 - 1.44 vvd-1之間。根據目標灌流速率，使用不同百分比的高濃度補液對化學限定培養基進行富集。Warikoo等報導了50 - 60 x 10^6 cells/mL的活細胞密度穩態操作維持約50天，以及使用ATF和0.04 - 0.05 nL/cell/day的CSPR進行活細胞密度50 x 10^6 cells/mL（CHO，rhenzyme）的操作。Xu等報導了細胞密度分別在42和68 x 10^6 cells/mL的穩態操作，使用手動細胞廢棄，最低CSPR為15和23 pL/cell/day。

CHO細胞灌流培養生物反應器穩態操作條件示例(J.Bielser，et al., 2018)。

使用非常相似的培養基比較不同工藝的性能，Xu等對各自產率進行了“公平”的比較，包括批次、補料分批（高或低密度接種）、濃縮補料分批以及灌流工藝。結果發現，所有生產模式中的細胞特異性產率范圍相似，所以反應器最終的單位體積產率取決于工藝所能達到的細胞密度。對于灌流、高接種密度以及補料分批，觀察到的產率值分別為2.29g/L/day、2.04g/L/day以及0.39-0.49g/L/day，這說明連續工藝可顯著強化工藝。

穩態或穩定操作

下圖所繪的設置包含了在線監測和廢棄率的控制，可實現在穩定細胞密度條件下的連續操作。其結果是，生物反應器內的環境達到恒定狀態，具有固定的生物質或細胞密度，即通常所指的穩態操作。按照其定義，在穩態下，沒有產物積聚在系統內，進入（IN）、離開（OUT）反應器以及所生產/消耗的物質的總和為零。相應地，反應器內所有的濃度和物理參數隨時間保持恒定，在一定程序上，必需是攪拌良好的罐，這些樹脂在整個反應器體積范圍內保持均一。

除了由化學反應或由于不同進/出液流而形成的成分的添加/去除外，在生物反應器內，還會發生其它一些過程，其與細胞生物學相關，且其動力學特性通常相對較慢。生物學反應速率不是恒定的，在工藝中，可能隨時間發生變化。由于灌流操作的時間會延長到數天、數周甚至數月，這種緩慢的過程可能最終會形成不可忽略的成分，且在運行過程中導致緩慢的“漂移”。例如，由于某些類型的細胞衰老過程，細胞特異性產率會隨時間降低。所以在描述灌流生物反應器時，“穩態”這個詞的使用需要小心，而且需要記住的是，整體的系統總會緩慢地“漂離”初始描述的穩態。

穩態操作已被證實，如Karst等使用代謝組學技術，在不同的操作狀態下觀察了代謝物的濃度，如核苷酸、核糖和脂質前體。在以穩定操作3天后，可觀察到代謝性穩態。有趣的是，在另一項研究顯示在6至7天的過渡后細胞內過程才達到穩態條件，如糖基化。Bertrand等使用轉錄組學和蛋白組學研究了細胞內、外代謝物的動態過程，鑒定了3組轉錄物，第一組在3天后達到穩態（大部分）、第二組在7天后達到穩態（中間組）、最后一組沒有達到穩態（小部分）。這說明，即使可以達到了穩定操作，即許多、甚至大部分代謝物達到了細胞內或外穩態，仍然會有部分生物學過程，在運行過程中會發生變化，但其可能只有極小的宏觀影響。

另一個常用詞是穩定操作，用于描述將關鍵工藝參數和質量屬性維持在良好確定的范圍內的操作。報導顯示，一些較小的干擾可使系統偏離穩定操作設定點，但使用良好確定的控制策略，其可被快速校正，使對產物質量的影響最小化。這就是對“穩定”這個詞的定義，指示了可提供具有在預先確定的界線或范圍內的產物質量屬性的反應器條件范圍。

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參考原文：J.Bielser, M.Wolf, J.Souquet, et al., Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing - A critical review. Biotechnology Advances, 2018, 36:1328-1340.

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