前言

在過去的數十年間，人們通常是將一群細胞中的每個細胞都視為相同的細胞進行研究的。但是，對這群相同基因的研究往往會忽視掉每一個細胞的特征。因為即使是在擁有同樣細胞經歷的細胞種群里，在轉錄或翻譯以及信號通路的噪聲方面，也存在著隨機波動，會形成內在的異質性。這些在看似由相同細胞構成的細胞種群里隱藏著的細胞-細胞之間的變異也許對疾病的產生和治療有著重要的意義。例如腫瘤細胞的異質性在理解腫瘤的誘發、進展、轉移與治療應答方面就有著重要作用。在臨床前藥物研研發過程中，極小比例的一群細胞亞型也許會導致腫瘤的抗性，它些細胞亞型也許與腫瘤患者治療后的復發有關。因此，隨著藥物變得越來越個性化，我們有更強的動機來更加準確地表示和理解單細胞以及這些不同的細胞亞型。對于細胞異質性的認識已經激發了人們對單細胞組學研究的熱情，這些組學包括基因組學、表觀基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學及其內在的相互作用。

傳統的激光共聚焦，流式和質譜技術已經被廣泛地運用到了單細胞水平的分析上。但是，共聚焦方法存在著局限，例如低通量，成本高，因此在對細胞狀態進行全局化分析，以及發現新型細胞亞型特征方面，使用這些技術并不現實。而流式細胞術則有著高通量的特點（每秒1000個細胞），但也有著局限，其中的局限就是，在流式分析過程中，細胞會受到物理作用，這些物理作用包括流體壓力，激光束照射，靜電壓，高電場，以及與容器壁相撞，這些因素都會影響細胞的收率與完整性。雖然前面提到的這些技術都能確定細胞表型，但是是流式細胞儀中采用的抗體是基于先驗知識，它限制了一些新細胞亞型的發現。此外，這些方法所需的細胞數目大概是100萬，同時它無法檢測細胞隨時間變化的代謝變化。而流式抗體的熒光光譜也限制了流式抗體的使用數目，使用參數過少。為了解決傳統的流式問題，有人開發了基于質譜與流式的質譜流式細胞儀，它能使用超過40個通道的參數。質譜流式的原理就是，使用重金屬（這些重金屬并不存在于人體內，主要是稀有金屬）來標記抗體。但這種技術還是無法檢測細胞的代謝活動，只能靜態地檢測細胞特征。由于質譜檢測器的低靈敏性，質譜流式無法檢測那些低水平表達的細胞特征。并且一次分析的數目也有上限。

為解決上述問題，以微芯片為基礎的單細胞組學技術應運而生。微芯片技術就是通過在微觀層面形成一個個的分析區室，這個區室與一個細胞的大小接近，而樣本的收集時間與反應時間也會縮短，同時還具備高通量的特征。此外，微芯片是在層流狀態下運行的，環境穩態，因此可以在單細胞水平上實現更加精確、更加靈敏的檢測。微芯片技術也為自動化，一體化，平行化提供了平臺，進而能節省人力物力，促進單細胞層面上的研究。

在Figure 1中我們就能看到微芯片技術在單細胞層面上的基因組學、表觀遺傳學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學。

基因組

遺傳突變會導致生物體基因的多樣性，而全基因組測序可以發現基因組上的突變，結構變異，非整倍體變化以及重組。但是一個細胞的基因組(gDNA)太小，在進行測序之前必須要進行擴增。現在通常采用PCR或異位多重置換擴增反應(MDA,isothermal multiple displacement amplification)來對單一細胞的整個基因組進行擴增。但這兩種技術會導致擴增偏倚，例如無法均一覆蓋整個基因組，產生嵌合DNA，堿基復制錯誤，假陽性，假陰性以及等位基因丟失(ADO，allelic dropouts)等。簡并寡核苷酸引物PCR(Degenerate-oligonucleotide-primed PCR)以及多次退火環狀循環擴增(MALBAC，multiple annealing and loop-based amplification cycling)可以改善單細胞全基因組的擴增效果。雖然這兩種方法比MDA有著更好的均一性，但是缺乏對全基因組，長鏈DNA產物的覆蓋，以及對單核苷酸的突變檢測能力低。MDA除了有擴增不均一以及擴增偏倚這種缺點外，它還有其它的一些局限，例如假性引物的相互作用（引物二聚體或DNA污染）來源的非特異性合成。因此，在單細胞全基因組測序領域仍然需要高度均一性以及高保真的擴增方法用于精確地識別indel，CNV，SNV，結構變異等。

為了改善單細胞WGA的擴增均一性以及減少擴增偏倚，微流控技術應運而生。微流控技術能將反應體系從微升級(microliter)降低到納升級(nanoliter)甚至皮升級(picoliter)，此項技術能最大程度地降低外源DNA的污染以及交叉污染。因為在微流控區室中，每個區室中含有級少量的DNA片段，這樣在DNA模板，引物與聚合酶之間的競爭就會降低。微流控技術還能改善反應動力學特異以及提高擴增的效率，因此能夠大大降低擴增偏倚。此外微流控技術能夠實現大量單細胞的平行高通量分析。

微流控技術的典型形態特征就是閥門，納米孔(nanowell），微滴。通過將反應體系降低到納升級，基于閥門的微流控硬件系統就會捕獲一個大腸桿菌(Escbericbia coli)細胞，并擴增它的gDNA，一次就能同時處理9個樣本，如Figure2所示。這種策略能夠減少試劑用量，降低實驗成本，改善擴增特異性（高達95%）。由于反應體系少，假性引物相互作用，DNA模型合成的非特異性，以及擴增偏倚都會降低。

我們將這種微流控系統的思路往前再推進一步，那么就可以在96孔板中同時對96個細胞進行捕獲，裂解，擴增。這種系統可以整合流體回路，形成大量的納升級反應體系。由于其高通量的特異，每個細胞都能產生約150-250ng的DNA，對一個細胞也能實現多重分析，實現靶向重測序，全外顯子測序（WES）與WGS。微流控系統能夠改善均一性，實現低ADO率，以及更小的單核苷酸錯誤。

微流控的平臺還能降低反應體系，改善WGA的均一性（figure2b）。這種方法可以在數千個固定的納升反應室中實現大量平行的DNA擴增。這種方法能實現對微生物細胞或哺乳動物細胞基因組的高度覆蓋，并且在從頭組裝基因組方面也有著極大的改善，它能夠檢測出一個成人神經細胞中細微的體細胞CNV。有報道指出，微流控系統能夠覆蓋大腸桿菌88-94%的基因組。

雖然閥門與微孔技術常常用于多步單細胞反應，但是精密加工與微流控的控制技術還存在著一些技術瓶頸，這些技術瓶頸限制了最大的樣本加工能力。不過現在這些問題已經通過液滴微流控技術得到了解決。這些技術可以將單一細胞的gDNA片段分散到大量的皮克級液滴中，在擴增中，降低試劑與DNA片段的競爭，因此會在保持高度精確性的同時，避免擴增偏倚（figure2 c）。例如，基因組的覆蓋范圍是59-89%，SNV的錯誤率是在20萬分之1以下，使用基于液滴的方法可以降低那些擴增中的復制錯誤。不過，這些平臺在進行下流的WGA分析之前，它們分離與選擇單一細胞要么是手動的，要么是FACS途徑。為了進一步提升通量，單一液滴MDA(sd-MDA)被開發了出來，這種sd-MDA技術通過一對一的液滴融合，在微流控的管道中，將MDA的試劑加入到已經包裹的單一細胞液滴中。此技術能夠在1小時內，1次處理幾萬個細胞，同時能夠實現每一個反應小室中更高的均一性與試劑分配，降低樣本與試劑損耗。sd-MDA技術可以更高范圍地覆蓋細菌與哺乳動物整個基因組，并降低污染。

雖然傳遞的微流控方法使用的是一些例如閥門，納米板與液滴技術，但是一些新的設計已經用于改進WGA。一種無閥門微流控設計已經可以通過微柱陣列（GAMA，micropillar array）來實現單細胞基因組擴增。當單細胞被芯片捕獲，并裂解后，微柱就能捕獲gDNA， 而其它成分，例如單細胞的線粒體就被沖走。純化的gDNA隨后就通過MDA進行擴增，整個過程在一個穩定的微流環境下進行，因此擴增產生會被沖到下游的儲存室，用于分析。通過基因位點采樣（gene loci sampling）與WES就能比較基于GAMA或基于FACS方法的實現的基因覆蓋。與FACS技術相比，在微流孔中能夠實現更高的基因組覆蓋，以及更低的擴增偏倚。

為了解決傳統復雜的微流控步驟與芯片平臺的精密加工問題，大量的聚乙二醇水凝膠已經用作微流控平臺來大量平行地檢測MDA。通過形成一個孔徑25nm的凝膠基質，細胞與DNA模板由于在這種凝膠中分散程度有限，它們就能形成區室。最終，這些擴增的產物就會局限在這些區室中，并且能夠最大程度地降低外源DNA的污染與交叉污染。這種方法能夠覆蓋大腸桿菌（E.coli）細胞基因組的30%，以及覆蓋金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因組的60%，其中只有0.5%的嵌合reads。

表觀基因組

表觀遺傳學研究的是同基因細胞內的功能基因組元件和它們的調控變化，這些調控變化能導致不同的基因表達差異。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化，組蛋白修飾與染色質組裝和染色體形成，它們在細胞行為多樣性，細胞發育和疾病方面有著重要的作用。在傳統研究中，我們通常會檢測細胞種群中的大部分細胞，這種檢測會隱藏表觀遺傳的異質性，因此最好在單細胞水平上分析表觀基因組。此外，傳統方法對于那些低細胞數目的樣本并不敏感，并不能發現這些樣本中的固有的特征。最近發展的微流控技術則能夠對單細胞進行高通量、高靈敏地表觀遺傳學分析。

Buenrostro使用了基于閥門的微流控平臺開發了基于轉座酶的染色質單細胞分析技術(scATAC-seq，single-cell assay for transposase-accessible chromatin)。使用這種技術，他們在一個集成的微流控芯片(integrated fluidics circuit，IFC)中捕獲并裂解了96個細胞。然后在芯片上進行ATAC，隨后釋放，Tn5末端延伸，以及PCR。從IFC上收集了單細胞庫后，給每一個細胞加上條形碼(barcode)，隨后將單細胞庫混合起來進行測序。使用這種方法，作者研究了254GM12878淋巴母細胞的DNA開合性(accessibility)，這些單細胞來源的數據顯示了整體檢測(bulk measurement）的相似性。此外，他們還估計了其它細胞系中數千的細胞的染色質開合性。DNA甲基化是第一個發現的表觀遺傳標記，通過亞硫酸氫鹽將胞嘧啶殘基轉化為尿嘧啶就能檢測DNA的甲基化。單細胞亞硫酸氫鹽測序和簡化代表性重亞硫酸鹽測序(RRBS,Reduced representation bisulfite sequencing)能夠以人工低通量的方式實現。此外，一種結合MDA的甲基化特異性酶鑒別方法能夠實現單細胞水平上的基因組表達譜與甲基化模式。這些方法都有可能被整合到微流控系統中。例如，基于微流控擴散的簡化代表性重亞硫酸鹽測序被開發出來用于檢測少量細胞的DNA甲基化，并被應用于檢測小鼠小腦中原代神經細胞和原代膠質細胞的分化。

此外，Rotem還報道了使用液滴微流控技術用于分析了數千個單細胞的染色質狀態。在這個裝置中，單細胞首選被區室化，然后裂解，并經過微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease)處理。當細胞被裂解后，染色質被片段后，含有染色質的液滴與DNA條形碼融合，標記每個最初的細胞。最后，匯集所有的液滴并測序。使用這種平臺，一個混合了小鼠胚胎干細胞（ES）、胚胎成纖維細胞和造血干細胞的一團細胞就能夠根據H3K4me2區室開來。源于數千的ES細胞的不同的染色質標簽也能用于確認表觀遺傳的異質性。

納米孔也有被報道用于高通量的scATAC-seq。在這種方法中，大規模平行的納米孔陣列被用于加載并分離單個細胞。然后，另入裂解液，轉位試劑(transposition reagent)，EDA，MgCl2，以及PCR試劑。為了確保數據是來源于單個細胞，分離的單的細胞還要進行熒光染色。這種方法能夠實現高通量（每張芯片1800個細胞），短時間（4到5小時）與低成本（一個細胞不到1美元）的單細胞表觀遺傳學測序。通過這種平臺，有人報道了基于表觀表達譜的人類外周血中的不同細胞類型。

轉錄組

轉錄組，尤其是單細胞轉錄組為我們提供了基因表達模式的思路，基因的表達模式反應了細胞的異質性。轉錄組是由一系列的mRNA轉錄本構成。當內部或外部對細胞產生影響后，例如細胞的分化狀態或外部的環境應激，單細胞的mRNA表達譜就會快速地發生變化。因此，這些mRNA的變化攜帶了有關細胞類型和狀態的豐富的生物信息。為了更加全面地理解在細胞種群與組織中，不同細胞的狀態和亞型，有必要來研究轉錄組。

在單細胞層面上確認和定量轉錄組的挑戰就是，單細胞的RNA量很少，只有皮克級。此外，這些少量的RNA在經過不充分的反轉錄后，以及低效率的擴增后，那些低豐度的轉錄本會丟失，從而產生偏倚。此外，RNA分子的易揮發和降解進一步降低了轉錄本的數量，增加了信號的噪聲，損失了檢測了精確與可重復性。為了能夠區分不同細胞的類型或狀態，發現罕見的細胞亞型，降低技術偏差和內在噪聲的影響，因此有必要進行高通量的單細胞表達譜研究。然而，在精確與快速的樣本操作與分離方面面臨著挑戰。基于微芯片的工具通過克服上述局限，它能夠利用少量的RNA，在納升反應室中對其進行處理，并能降低污染，減少試劑消耗，提高捕獲效率。微流控平臺的小型化與并行化提供了更簡潔，更靈活的單細操作方法，實現了對單個細胞轉錄組的高通量和低成分的分析方法。

常用的轉錄組分析技術包括RNA熒光原位雜交（RNA-FISH），定量PCR（qPCR）與mRNA-seq。FISH是一種檢測并定位一個細胞中mRNA的有效方法。利用時序FISH(sequential FISH)和超分辨成像技術，可以檢測單細胞中的數萬個mRNA。Matsunaga等人開發了一種微流控裝置，可以通過FISH技術來檢測多達100個單細胞。作者使用采用優化了空腔尺寸的聚對苯二甲酸乙二醇酯的微網，能夠在短時間內高效率地捕獲細胞。此設備成功地區分了不同細胞種群中的mRNA的表達水平，并使用FISH檢測了單細胞水平上的β-actin。Kao等人開發了另外一種整合FISH微流控平臺用于檢測腫瘤細胞系中的HER2，此平臺包含一種全自動化的FISH程序，如Figure3所示。通過使用微泵和微閥，在同一個設備中可以集成多個功能，從而DNA探針的使用和操作時間就會減少。同時試劑消耗也會降低70%。

此外，RT-qPCR廣泛用于分子生物學實驗，它用于定量基因表達水平的差異。該技術有著高靈敏度、高特異性和極大范圍的線性，并已經用于單細胞基因表達分析，不過在常規系統里，它并不可靠。Eastburn使用了一個基于液滴的微流控裝置，報道了一次運行中的5萬個單細胞的RT-PCR（Figure 3e）。使用這種方法可以從混合的細胞群體中高度特異性地挑出目的細胞，這表明該方法在稀有細胞的分析中有著應用潛力。液滴微流控平臺也表現出了對目標細胞的高通量分選能力。FISH和RT-PCR平臺的缺點在于它們采用的是相對定量的方法，在一次實驗中，它們只能對已知的基因的數目進行檢測。因此，這些方法無法從一個細胞中發現全局的信息。這些方法還依賴于我們對目標轉錄本的先驗知識，從而阻礙了新基因的發現。

為了克服FISH和RT-PCR平臺的局限性，單細胞RNA測序現在已經成為了分析基因表達異質性的重要工作。這種廣泛應用的方法使能夠以一種客觀及無偏的方式在整個轉錄本水平上對基因表達進行檢測。在對單個細胞進行分離和裂解后，mRNA被逆轉錄為cDNA，然后通過全轉錄組擴增（WTA，whole-transcriptome amplification），最終進行測序。兩種常見的生成cDNA的方式就是oligod(T)錨定和模板轉換法(template-switching)。但是oligo-d(T) 錨定法會導致嚴重的mRNA偏倚，因此這種方法對3‘末端有著偏好。模板轉換法則解決這個問題，這種方法采用了MMVLRT酶(MMVLRT全稱是Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，即莫洛尼鼠類白血病病毒逆轉錄酶)，這種酶具有末端轉移酶活性以及模板轉移能力。因此，非模板胞嘧啶殘基可以通過末端轉移酶添加到cDNA的3’末端。這種方法就會產生一個多聚鳥苷模板和銜接序列(adaptor sequence)，此序列可以使MMLVRT產生一個包含完整5'末端的mRNA的全長的cDNA轉錄本。這兩種方法都通過PCR進行擴增。獨特分子標簽(UMI，Unique molecular identifiers)通常用于在WTA之前對每個原始mRNA進行標記，通過下游對原始數據的均一化和質控能夠降低擴增偏倚。擴增后的cDNA文庫被加上條形碼，隨后混合，使用NGS進行測序。

如上所述，基于閥門的方法通量比較低，并且非常耗時，還需要專業的工程學知識。盡管存在著這些缺點，基于閥門的方法也由于其高度可控性而被廣泛使用。Street設計了一種RNA測序微流控裝置，用于在芯片上捕獲，裂解以及逆轉錄單細胞(figure3b)，并且在此芯片上，還能完成polyA加尾，引物消化以及第二鏈cDNA的合成。同時，該芯片還能實現擴增，純化，文庫制備和測序工作，使用此技術從10個小鼠的胚胎單個細胞中獲取了高質量的cDNA，以及在每個細胞檢測到了8000個基因。使用這種方法還發現了小鼠骨髓來源的樹突細胞，小鼠大腦細胞以及人類大腦細胞的多樣性。但是通過一些手段，例如控制軟件，則能夠增加通量，降低操作時間，這樣就能最大程度地提高基于閥門的裝置的利用。這項研究表明，將以前基于手動的閥門微流控進行自動化后，就能夠極大地提高通量與加工效率。KATARA(全稱為Kit for Arduino-based Transistor Array Actuation)也引入了一個帶圖形用戶界面的python包，因此這種操作并不需要太專業的硬件知識。

此外，基于微孔的方法能夠減少對專業設備的需要，降低未利用到的體積，并有利于實現并行化操作，從而能夠提供更高的可擴展性和簡并性(Figure3c)。細胞培養與成像系統也能與微孔平臺兼容。Seq-Well是一種用于單細胞RNA測序的低成本，可移植和大規模平行測序的平臺。這種平臺可以通過重力以及加了條形碼的poly(dT)來捕獲單細胞，最終能夠將細胞分散在86000個亞納米孔中。由于每個納米孔只能容下一顆微珠，裝載效率高達95%。納米孔是用于半滲透碳酸酯薄膜密封的，而非礦物油。這種膜可以在細胞裂解過程中進行溶液交換，同時還能捕獲生物大分子，能夠更好地捕獲mRNA，并最大限度地降低交叉污染。當裂解，捕獲mRNA后，就開始反轉錄，擴增，文庫制備，雙端測序。這個硬件已經成功地用于研究暴露于結核分枝桿菌后的數千個原代人類巨噬細胞。

基于液滴的方法為單細胞RNA測序提供了可擴展性，其本身也具有大規模平行測序的特點。這類方法主要的平臺就是Drop-seq與InDrop平臺，它們利用微流控硬件將單個細胞人、試劑和加有條形碼的微球或水凝膠微球封閉在油滴中（Figure 3d）。這些條形碼由一個PCR引物，一個獨特的細胞編碼，一個UMI構成，它們用于區分捕獲的mRNA，而poly(T)用于與多聚腺苷酸產mRNA結合。裂解、反轉染和PCR都是在液滴中進行的。因此這些反應被限制在液滴中，而最終擴增的轉錄本含有獨特的標簽，因此這些平臺可以將所有的液滴匯集起來，方便了液滴乳化后的后續處理過程以及文庫制備。當測序數據比對到一個參考基因組后，就可以通過一個數字基因表達矩陣進行組裝，再根據細胞上的標簽來區分每個細胞，使用UMI來對轉錄本進行定量。使用這種方法已經研究了大量的小鼠ES細胞和視網膜細胞，提示了詳細的群體結構和新的候選細胞亞型。雖然這些設備可以低成本地每小時處理數以萬計的細胞，但是在液滴形成過程中，由于控制較少，因此會導致封裝效率低下。此外，由于mRNA捕獲效率比較低，這就是限制了這種方法對于那些低表達的轉錄本的檢測。當處理含有少量細胞的小樣本時，這種方法就會顯得力不從心。此外，這種方法還需要其他附加設備，因此限制了其它不同實驗室的使用。

包括miRNA在內的小RNA在調控異質性細胞種群中發揮著重要作用。miRNA是一類小的非編碼RNA，它們在許多生物系統中能調控基因的表達。在細胞中，miRNA可以通過與mRNA互補來調控mRNA的表達，從而誘導mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯。現在已經開發了一些基于微芯片的技術來對miRNA進行定量分析。White等人開發了一種帶有可控氣動閥門的微流控裝置用于檢測單細胞的miRNA表達，此裝置還整合了從細胞捕獲到qPCR的所有處理步驟。該平臺一次運行能夠檢測300個細胞，同時還能將試劑的消耗降低1000倍。還有人開發了一種流動FISH微芯片來檢測以及定位miRNA。通過這種方法，Wu等人以可視化的方式展現了由離子霉素誘導的Jurkat細胞中CD69和miR-155的表達，并同時對PMA進行了定量。Guo等人開發了一種連續流動的微流控裝置，此裝置使用DNA雜交的方式擴增了目標miRNA的信號，這是一種非PCR式的miRNA分析方法。這種分析方法能夠在油包水的液滴中分離細胞，此液滴中還含有DNA擴增子。當細胞裂解后，miRNA就會與DNA擴增子相互作用引發雜交反應，產生熒光信號，并循環產生最初的靶向序列。這種循環開啟了一個循環級聯反應，放大了的熒光信號，同時并不使用PCR對miRNA進行擴增。作者采用這種方法能夠在每分鐘內處理300到500個細胞。對三種不同的乳腺癌細胞進行分析后，作者確定了miRNA的表達水平與腫瘤分期的相關性。最近，有人報道了使用少量樣本或單細胞來進行捕獲，miRNA擴增以及測序。微流控技術的進一步使用將會對數千個單細胞進行全基因組測序。

蛋白質組

除了轉錄組外，蛋白質組有助于構建表型與基因型之間的關系。蛋白質組包括膜結合型蛋白，細胞質蛋白和分泌蛋白。蛋白的濃度、翻譯后修飾、細胞器轉移、酶或功能活性以及與其它蛋白質或分子的相互作用也會影響到蛋白質表達譜。蛋白質在細胞分化、DNA復制、信號轉導、代謝反應和分子運輸等重要的細胞功能方面發揮著巨大的作用。因此，蛋白質組的研究可以推斷生物學機制，并能發現與正常發育或產生相關的生物標記物、治療靶點和其它蛋白質或蛋白質相關的復合物。盡管與轉錄組相比，蛋白質可能具有較少的噪聲，但是要高保真地定量單個細胞的蛋白質組的挑戰也更大，部分原因是整個蛋白質組的規模要大于轉錄組的數量級，并且大多數信號蛋白具有低豐度和不穩定性。與DNA和RNA相比，蛋白質無法直接通過擴增來提高信噪比。蛋白質組的極度復雜性和缺乏一致的通過探針為單細胞蛋白質組分析增加了額外的困難。目標的技術在單細胞水平上檢測蛋白質的通量與靈敏方面仍然存在局限。為了實現高靈敏度和多路復用的單細胞蛋白質分析，微生物平臺已經得到了廣泛的研究和使用。

單細胞可以被包埋在納米孔中，其分泌的蛋白質可以被預涂有抗體的玻片捕獲，每個細胞最多能檢測4個蛋白。單細胞條形碼芯片以能夠在單細胞水平上對多個蛋白進行檢測。更特別的地方在于，這些芯片含有預制備的抗體條帶，這些抗體能覆蓋特定的蛋白，可以通過熒光免疫分析的手段來對蛋白進行定量。Ma等人開發了一種單細胞條形碼芯片（SCBC，single-cell barcode chip），此芯片能夠檢測單細胞分泌的一系列蛋白。利用控制閥門，他們將隨機加載的單細胞分散到數千個納米孔的微室中。細胞分泌的蛋白被一個微室中由DNA編碼的抗體庫所捕獲，該抗體庫是以平行條帶的方式來排列的。蛋白濃度是通過免疫夾心法熒光成像方式來進行檢測的。通過這種平臺，Ma檢測了腫瘤抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞分泌的13種效應分子。與健康細胞相比，MART-1（全稱為melanoma-associated antigen recognized by T cells 1，T細胞識別黑色素瘤抗原-1）特異性T細胞受體轉基因型CTL表現出更高的異質性和功能多樣性。

通過優化、簡化最初的SCBC的參數，Lu等人報道了一種帶有5000個微槽的芯片設計，此裝置能夠分離單個細胞并對其進行多種蛋白檢測(Figure 4 a )。與基于閥門的方法相比，此方法在工作流程和裝置上都減少了復雜性和體積。細胞通過管道輸送到的芯片上，并通過策略加載到微槽中。通過位于微槽頂部疊加的高密度的抗體條形碼陣列來檢測蛋白，從而會形成一個熒光免疫夾心。當細胞孵育12小時后，分離夾心，使用檢測抗體來捕獲相應的細胞因子，并用微陣列掃描儀進行定量。通過結合不同熒光顏色的光譜編碼和15條空間編碼條帶，該平臺能夠同時檢測42個效應蛋白，這代表了迄今為止單細胞分泌蛋白分析的最高水平。該裝置與活細胞工作站和顯微成像系統的兼容也使得分泌蛋白譜與細胞遷移或相互作用之間的相關研究成為可能。到目前為止，該平臺已經應用于細胞信號轉導、免疫應答、腫瘤發生和細胞治療中功能異質性的研究。

Hao等人報道了一種連使用連續微刻的方法來監測單細胞分泌細胞因子的時間動力學。在這種方法中，單個細胞被分布和分離在密集的亞納米孔（84672個）中，頂部有一張抗體包被的玻片，它能同時監測三種不同的細胞因子的釋放。為了檢測在不同時間間隔內單細胞蛋白的分泌，在不同的時間點，要將使用過的抗體包被的玻片換為新制備的玻片。使用這種方法，研究人員檢測了非粘附T細胞和粘附巨噬細胞的動態細胞因子分泌。Lu等人展示了玻片交換過程中可以加入一個干擾步驟。作者因此在使用LPS刺激同一巨噬細胞前后，在同一巨噬細胞上檢測了42種不同的分泌蛋白。

除了使用抗體包被的基質（如玻片）捕獲目標蛋白外，與微球結合的抗體也是繼液滴或微孔內的單細胞分離之后進行蛋白質檢測的重要工具 (Figure 4 b )。Konry開發了一種使用液滴微流控技術來包裹T細胞，捕獲抗體修飾微球的技術，此技術通過熒光標記的二抗來檢測蛋白的分泌。雖然這種方法允許在活化的輔助性T細胞中檢測IL-10的分泌，但是這種檢測方法限制了可以同時檢測的多個蛋白，并且操作時間過長。另外，單細胞和功能化的抗體微球也可以與熒光標記的二抗包埋在微流控和反應區室中。然后根據微球的熒光強度，可以隨著時間的推移來監測細胞分泌的活動的動態特征。

除了使用閥門、微孔或液滴這些傳統方法外，納米孔-杠桿技術最近也成為了檢測單細胞分泌體的一種新的解決方案（figure 4c)。這種方案提供了獨特的優勢，例如實時檢測、單分子級的靈敏度，以及不依賴于抗體的先驗知識。為了能檢測分泌蛋白，在微流控裝置內的納米孔里，使用光鑷來捕獲單個細胞。分泌的細胞蛋白通過納米孔產生明顯的阻斷電流，電泳的大小與蛋白的體積有關。Kennedy等人使用這種方法實時區分了三種不同的腫瘤細胞株，U937、MDA-MB-231和MCF-7，并對趨化因子CCL5和其它低豐度的生物標記物（PI3，TIMP1和MMP1）進行了鑒定和動態追蹤。

上述提到的方法是以無損傷的方式檢測細胞的分泌蛋白。但是，如果要研究胞內蛋白，就必須要在微流控芯片上集成細胞裂解、蛋白質釋放和最終檢測等功能。一種基于閥門的方法就能解決這種問題，在這種平臺上，當單細胞通過三態閥被分離，裂解，加標簽后，再利用單分子熒光計數手段來對蛋白進行區分和定量。通過這種靶向方法，不需要的蛋白就通過電泳的方式沖走，而柱面光學系統則用于定量感興趣的蛋白。Shi等人報道了通過引入含有裂解液的額外相鄰腔室的改進型SCBC（Figure 4d）。使用這種方法，捕獲的單細胞就能在芯片上進行裂解，隨后分散到裂解液中，翻譯出來的蛋白質通過含有11種抗體的條形碼帶進行檢測。通過這種平臺，他們研究了三種腫瘤膠質母細胞瘤多形細胞株在不同刺激條件下的細胞內信號蛋白。為了提高檢測那些低拷貝數的胞內蛋白質靈敏度，使用微孔（60pL）來提高釋放的蛋白濃度，并減少細胞裂解后蛋白擴散的時間。Yang等人報道了，使用4種不同大小和3種不同熒光顏色的抗體結合微珠檢測了分離出來的循環腫瘤細胞的12種蛋白。

此外，Abseq方法能達到更高的通量，它每小時能分析10000個細胞的蛋白，并能夠檢測出更多的膜蛋白（Figure 4e）。在這種技術里，抗體使用了DNA標記，并含有一個UMI，還含有抗體特異性序列，它們能夠分別識別PCR的重復序列，以及感興趣的蛋白。分離了單細胞后，使用蛋白質酶K裂解液來裂解細胞。然后，通過三個液滴的融合，將單細胞裂解產物、單細胞條形碼和生成的PCR合并成一個。隨后使用重疊延伸PCR技術將細胞特有的條形與抗體條形碼耦合起來。通過增加每個抗體的DNA標記數，可以進一步優化檢測靈敏度。到目前為止，這種方法僅限于檢測表面蛋白。但是，從理論上講，序列標簽可以唯一地標記針對細胞內分泌蛋白或整個蛋白質組的抗體，這就能夠有更大的機會找到新發現。

單細胞Western blotting(scWestern)是另外一種分析蛋白方法。Hughes等人使用scWestern技術，一次分析了數千個單細胞中的2到3個蛋白，但是如果重復漂白和復染，則能檢測多達11個靶蛋白(Figure 4 f )。當細胞在開放的微孔陣形中鎖定后，單個細胞就在芯片上被裂解。然后使用PAGE凝膠電泳分離細胞裂解液中的蛋白，隨后使用光引發印跡（photoinitiated blotting）方法來固定蛋白。最終使用熒光標記的抗體進行檢測，并用微陣列掃描儀進行定量。Hughes使用這方法不僅可以檢測蛋白，還能夠區分異構體。該方法還可以應用于大刀神經干細胞、膠質母細胞瘤細胞，CTCs以及不同亞細胞區室的分析。

最后，細胞免疫染色是一種直接的檢測胞內蛋白的技術，它可以很容易地集成到微流控芯片中。可以使用水動力，電活性微孔陣列或數字微流控裝分離單個細胞，并使用免疫化學試劑對細胞進行染色。染色的細胞隨后可以通過熒光顯微鏡或微流控流式細胞術來進行分析。Ng等人已經使用此策略來對單細胞進行培養、刺激和檢測。這種裝置能用于檢測血小板衍生生長因子受體及其下游信號蛋白Akt的磷酸化狀態，研究化學刺激對血小板衍生生長因子受體磷酸化狀態的影響。

代謝組學

單細胞水平上的代謝物為基因型和表型之間提供了另一種聯系。代謝物包括所有的細胞內、細胞膜和分泌型代謝物，包括脂質和碳水化合物。單細胞代謝譜與其它組數數據進行整合時，通過提供代謝中間產物的更全面的數據，有助于識別基因型-表型的相關性。最近，代謝組學已經應用于藥物開發和傳遞，毒理學以及生物標記物的發現。然而，由于代謝物比生物分子（例如DNA和蛋白質）小，因此很難于其進行表征。從傳統角度來講，多個單細胞隔離平臺，例如使用激光燒蝕電噴霧電離(LAESI)和基質輔助激光解吸離子化技術（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)結合質譜技術來分析代謝物。然而，由于代謝物比生物分子更小，傳統的方法無法在不成比例地稀釋樣本或總體樣本損失的情況下來處理如此小的樣本。這些方法也缺乏檢測單個細胞中存在的微量代謝物所需要的靈敏度。

微流控裝置作為單細胞高通量代謝研究的有力工具，具有很大的應用潛力。盡管微流控裝置已經被用于研究代謝物的平臺，但是很少有研究將其應用于單細胞水平上代謝物。另一個挑戰則是，大多數單細胞裝置只出現在特定代謝物上，限制了它們在特殊領域的應用，無法實現多個代謝物的分析。此外，由于特定的代謝物研究是基于先驗知識，有關新發現的機遇仍然只限于微型硬件技術。盡管微流控技術在提高通量方面有著巨大的潛力，但是它們在改變正常的細胞行為方面還存在著挑戰。這會產生一些人為因素，這些因素有可能不利于代謝組學的研究，因為代謝物在單細胞水平上的濃度極小。盡管存在著這些挑戰，但是單細胞代謝組學的分析系統仍然在進步中。

Cheng等人提出一種微電極-微流控系統，此系統可以產生單個跳動的心臟細胞的代謝譜。在人工模擬心臟跳動的微電極場刺激后，電化學生物傳感器就會檢測單細胞中乳酸的生成。細胞外pH和細胞內鈣熒光，以及細胞收縮力，也能通過原位顯微鏡進行評估，這種技術為心臟細胞的電位狀態和代謝狀態指明了方向。

在一個高通量的研究中，Boedicker等人使用基于插頭的微流控將單個細菌捕獲到納米液滴中。釋放的代謝物可以更容易地通過隨機約束（stochastic confinement），在這種情況下，代謝物會保留在細胞附近。研究者利用利用甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的代謝譜檢測了藥物的最低抑菌濃度，并從人血漿標本中鑒定出敏感和耐藥的金黃色葡萄球菌菌株。該平臺有利于對同一樣本進行多種檢測，說明了其在有效的點對點診斷和針對患者的細菌感染治療方面有著應用。

單細胞代謝物可以通過特定傳感分子來檢測。Tang等人開發了一種用于胸腔積液腫瘤細胞葡萄糖攝取測量的微孔芯片平臺(Figure 5a )。當細胞被加載到含有200000個微孔的設備上時，一個熒光葡萄糖類似物2-NBGD就加進去，與細胞共同孵育，然后用自動高速熒光顯微鏡對微孔芯片進行掃描。使用計算機算法對圖片進行分析，以確定標記出那些高葡萄糖攝取的癌細胞，以便于進行后續的單細胞測序。此外，Molter等人設計出了一種玻璃微芯片，該芯片包含一個氧傳感器，氧傳感器是由鉑磷-聚苯乙烯珠制成的，并沿著微孔底部分布。當細胞浸入培養基中，并接種后，有一個連接在活塞上的玻璃蓋子就會關閉，在微孔上形成一個封閉膜，隨后就檢測氧含量。

另外，Xue等人報告了一種通過SCBC對單個細胞的代謝物和蛋白質進行多重分析的，集成自動化微芯片方法 (Figure 5 b )。他們使用DEAL方法，將代謝物特異性的大分子探針和蛋白捕獲抗體固定在單細胞微室的條形碼上。單細胞（每張芯片100個細胞）通過裂解液在芯片上裂解，然后用可編程閥門進行分割。代謝物是通過競爭性結合的手段來進行分析的，而蛋白質則是通過可視化的夾心免疫熒光法來進行分析。利用這種平臺，研究人員使用了表皮生長因子受體抑制劑(EGFR)埃洛替尼(Erlotinib，此藥物能夠降低腫瘤細胞的葡萄糖消耗)治療24小時后，研究了每個患者來源的膠質母細胞瘤神經球腫瘤模型細胞的代謝物。作為葡萄糖消耗的替代品，有4種代謝產物和7種與代謝相關蛋白質和磷酸化蛋白被納入檢測范圍，數據都表明了葡萄糖的攝入量總體上是減少的。此外，還能通過多個代謝產物的摻入來鑒定出兩種不同的代謝表型。

Xue還開發了一種整合了用于定量單個細胞攝取谷氨酰胺的表現競爭分析方法的SCBC芯片。他們分析了16種代謝物、磷酸蛋白和相關代謝酶。在先前工作的基礎上，他們使用芯片研究了埃洛替尼治療后勢能與受體酪氨酸激酶信號之間的關系。這些單細胞的研究表明，盡管葡萄糖攝取和磷酸化蛋白信號轉導減弱了，但是癌細胞的勢能卻增加了。此外，他們還發現了細胞通量過程和磷蛋白信號之間的新的相互作用，這就能解釋癌癥患者隊列中對EGFR抑制劑的耐藥性。

多組學

盡管基因組學、表觀基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等技術在分析單細胞方面取得了進展，但是單獨評估每一類分子還不足以充分了解復雜的生物系統以及潛在的調控機制。通過測量同一個單細胞的多組學水平，而不是合并從不同細胞獲得的不同數據集，就可以清楚地確定基因型-表型連接。通過這些平行的研究，就可以闡明更復雜的作用機制的細胞異質性。例如，對表觀基因組的研究就可以更好地理解對細胞特性、功能和表型的調節，而這些則無法單獨從基因型來預測。此外，miRNA與mRNA的共序列分析，則對miRNA導致的非遺傳性細胞異質性的轉錄后調控和miRNA通過蛋白質編碼區基因調控提供了新的思路。另外，單細胞轉錄組和蛋白質組的研究則提供了表達動力學的研究思路。隨著這些研究為細胞異質性提供了更加全面的理解，這些技術在人類健康和疾病方面的應用將會繼續推進。這樣的技術伴隨著對醫學研究有更深理解力以及促進的巨大潛力，微流控設備現在已經日益推動著多組學研究的進步。然而，現在想要在同一個設備上對同一個細胞進行多個層次組學的研究還是一項具有挑戰性的工作。這是由于不同的生物分子檢測和方案的不兼容性，這些不同的分子具有著不同的靈敏性和特異性要求。

Hao等人報道了一種集成的微芯片平臺，該平臺帶有可控的膜閥，可以同時對同一單細胞進行WGA和WTA，從而對來自同一個單細胞的基因和轉錄本進行檢測。這種方法允許在芯片上分離和擴增來自于同一個單細胞的細胞質mRNA和細胞核的gDNA。在微室中捕獲單細胞后，使用高選擇性裂解液連續裂解細胞膜和細胞核，分別收集胞漿和細胞核內容物。然后在該裝置上將mRNA反轉錄為cDNA，并對同一細胞的cDNA和gDNA進行全庫擴增(Whole pool amplification,WPA)。在進行PCR后，進行凝膠電泳，測序，最終就能夠鑒定出來自于同一單細胞的基因組和轉錄信號。這種技術進步提供了研究干細胞發育控制、非基因細胞間變異性、表觀遺傳調控和其它基礎生物學問題的解決方案。

Strijp等人開發了另外一種方法，這種方法利用壓力驅動的微流控來研究基因組和轉錄組。在這種微流控芯片上，使用水捕獲單個細胞，然后依次導入細胞膜和細胞核裂解液，提取芯片上的單細胞DNA和RNA。這種兩步驟裂解法避免了專門的清洗步驟，從而減少了樣本的損失。從每個微孔中收集每個細胞的裂解液，然后在芯片上進行DNA的WGA。在芯片上進行反轉錄和RNA擴增后，就可以對產物進行測序。這種技術和貝葉斯計算通路模擬的整合已經用于從大腸癌細胞系的轉錄組數據中識別單個細胞的腫瘤驅動通路。這些通路后的驅動突變都來源于同一個單細胞的DNA。此平臺有望用于腫瘤細胞異質性的研究，并通過其功能和突變途徑的建立來分析單個CTCs。Cheow等人通過一種基于閥門的自動化高通量微流控平臺在單細胞水平上同時檢測了DNA甲基化和基因表達，這種技術作者稱之為基因型，表達與甲基化的單細胞分析（single-cell analysis of genotype, expression, and methylation），作者研究了正在進行重編程的原發性肺腺癌和人類成纖維細胞。

單細胞多組學的另外一個研究主題就是轉錄本和蛋白質的相互作用。George & Wang開發了一種微流控裝置，可以對同一個細胞的轉錄本和分泌蛋白進行研究。這種可拆分的單細胞芯片集成了一個高度密度的抗體陣列來檢測膠原包被的納米孔中的分泌蛋白。當蛋白被ELISA分析后，再通過手動操作通過WTA對單細胞的mRNA進行測序。作者通過這一工作流程，他們鑒定出了一類與小鼠巨噬細胞中腫瘤壞死因子α分泌相關的共表達基因的細胞亞型，表明它有可能對免疫系統的調節機制提供新的思路。Junkin等人使用一種基于閥門的自動微流控平臺，在同一臺裝置上檢測了細胞因子動力學和LPS刺激巨噬細胞后的mRNA轉錄本。在這種裝置里，抗體功能化微球與單個細胞共培養，可以檢測細胞因子的分子。通過雙抗體夾心法可以檢測細胞因子的熒光強度。最終對單個細胞進行mRNA檢測。還有人通過一種基于閥門的平臺，研究了在佛波酯的干預下，MCF7細胞的轉錄組和蛋白質組的應答情況。

液滴微流控裝置是同時檢測RNA表達和蛋白質的另外一種強大的工具。在與DNA條形碼抗體共同孵育后，染色的細胞就被包裹在含有微珠的納米液滴中，這樣就能捕獲mRNA與寡核苷酸標記的抗體。經過反轉錄、擴增和測序后，從轉錄組和蛋白質組中獲得的信息就能被解析出來。作者使用了這種方法對人源CD8+淋巴細胞和臍帶血單個細胞的異質性進行了研究。最近，一種基于核酸適配體(Aptamer)的技術被開發了出來，用于平行研究轉錄組和蛋白質組。這種方法使用核酸適配體探針來標記那些含有表位與目標蛋白的細胞，并將其與DNA條形碼微珠和裂解液共同包埋起來。mRNA的polyA序列與核酸適配體就會使得細胞裂解后與微珠雜交。當進行了RT和PCR之后，就匯集所有的液滴，進行平行測序。由于含有共同的細胞特異性條形碼，這種平臺就是能串聯分析細胞全局數據（epitome ）與轉錄組數據。這種平臺能夠基于核酸適配體表面結合以及基因表達模式來區分不同細胞類型。

如上所述，Xue等人報道了一種基于閥門的SCBC，此技術整合了表面競爭結合分析法與功能蛋白免疫分析法，以及熒光讀數法，能同時研究代謝物和蛋白質。此外，Zhang等人使用納米孔技術展示了一種基于微芯片的平臺，該平臺能夠使用基于圖像的流式技術與抗體編碼微陣形技術來檢測單個CTC的葡萄糖攝取和胞內功能蛋白。從裂解的細胞中提取單個細胞核，隨后進行基因突變的研究。

總結與未來展望

微芯片技術的小型化和并行化為單細胞組學的研究提提供了前所未有機遇，這是因為微芯片技術提高了單細胞組學的通量、靈敏度和可控性，降低了樣本消耗。正如本文所討論的，這些方法在細胞發育和異質性方面的新發現和獨特發現為基礎研究和精準醫學提供了最新的工具。

盡管前人做了大量的工作，但是在利用微流控平臺進行單細胞組學研究時，仍然存在著大量懸而未決的問題。未來研究的一個方向就是進一步提高靈敏度、通量和多路復用，進而減少組學研究中的誤差和偏倚。此外，具有不同模式的微芯片器件的多樣性給質量帶來了很大的挑戰，因此制定分析標準與結果解讀標準對未來的進一步的發展有著重要意義。

此外，從同一個細胞上平行測量多個水平的基因組特性仍然不太完善，但是為了更準確和更全面地了解細胞類型的狀態，這還是有必要的。雖然近年來在綜合多組學方面取得了很大的進展，但是這些技術大多只能同時檢測兩個組學層次或三個組學層次。理想的平臺則是能夠提供各個分子水平上綜合信息。此外，在芯片上集成這些細胞組學的數據與細胞表型結合（例如細胞的大小與形態）以及動態特征（例如細胞生長、增殖、遷移和細胞與細胞之間的相互作用），能夠最大程度地提供更多的信息輸出。為了從同一個細胞中獲取這些聯系，需要一種精確、簡便的下游分子圖譜檢索方法。如果能夠在單細胞水平上完全將這些分子特性轉換為細胞行為，則能夠為研究提供強有力的支撐。這些未來的進展可能會增加單細胞數據的集的復雜性和廣度，從而?新型的計算模型來拆分高維數據。另外，在單細胞處理過程中，在保留三維位置空間信號的同時，對多組學數據進行整合的手段還不成熟，從而阻礙了對復雜生物組織結構和功能的全面理解。

最后，基于微芯片技術的商化和臨床轉化還有很長的路要走。為了加速這些技術在生物學和醫學中的廣泛應用，必須開發出功能強大、用戶友好的硬件設計。微流控裝置的集成和自動化不僅降低了生物學家和臨床醫生的使用門檻，并且還能減少人工操作，節省時間。這種做法還能降低用戶的實驗偏倚，并提高不同實驗室之間研究的可重復性，這些都是當前人工操作過程中需要注意的問題。成本很有可能是在單細胞組學研究中廣泛應用微芯片的另外一個障礙，這個問題可能通過進一步改進工作流程來得到解決，例如減少反應試劑的用量，提高樣本的處理能力。這些設備的標準化和規模化生產也會有助于降低成本。

通過基因組學、表觀遺傳學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的多組學微流控制技術的流水化集成，就能夠實現對細胞全部異質性的達珍。通過解決通量低，低靈敏底，研究水平低、缺乏足夠和可行的計算模型以及微流控器件高成本等問題，研究者和從業人員可以在與健康和疾病相關的細胞亞型和物質的發現中使用這些技術，從而推動單細胞組學在生命科學和醫學中的廣泛應用。