基于微流控芯片技術的CTC檢測新方法

2023-05-23 09:36:52 蘇州汶顥微流控技術股份有限公司已讀

近期，一項基于微流控芯片技術的CTC檢測新方法出現，相關研究結果發表在國際化學領域頂級期刊《Angew Chem》上。《Angew Chem》是化學領域影響力最大的期刊之一，在業界享有極高的聲譽（2017，IF=11.994）。

循環腫瘤細胞（CTC，Circulating Tumor Cell），即腫瘤在生長過程中，向血液循環中釋放的各類腫瘤細胞的總稱，是導致腫瘤擴散的關鍵因素。

CTC從腫瘤病灶脫離后進入外周血隨血液流動，沿著血流方向來尋找合適的“土壤”來生長，最后要么被毛細血管截留或者粘附在血管壁上，要么就在外周血中循環最后被清除，只有極少數目的 CTC能附著在血管壁上，重新穿過血管，到達新的“土壤”，適應環境后成長為新的腫瘤。

CTC是一種生物標志物（biomarker），這是目前臨床研發與應用的重點，是被寄希望用于癌癥預后、分期診斷、療效監控、復發預測、用藥指導、早期檢測等的標志物。與經典組織活檢相比，具有腫瘤分子信息全、侵入性小、取樣方便、成本低等優勢。

CTC檢測的最大困難在于其在外周血中含量稀少，通常1 mL外周血中含有109個紅細胞，106個白細胞，而可能只含有1-10個CTC，在如此龐大復雜的正常細胞背景干擾下，比如巨核細胞、內皮細胞，未成熟的造血細胞，上皮細胞等，很難實現高靈敏、高特異的CTC 捕獲檢測。

盡管目前市場有各種各樣用于分離及檢測CTC技術，但由于缺乏必要的敏感性，它們的臨床應用并不被廣泛采用，大多數技術往往受到捕捉性的限制，在捕獲的高效率與高純度之間難以進行權衡。現在已經使用的微型柱和人字形結構成功的證明可以增加細胞和免疫表面相互作用，提高捕獲效率，可遺憾的是，這種增強的相互作用是非選擇性的，與非靶細胞相互作用的均等性機會將導致最后捕獲的CTC純度并不是很高。

Now，我們來了解這款新的CTC捕獲設備及方法：SDI-Chip，Size Dictated Immunocapture Chip，基于尺寸大小的免疫捕獲芯片技術。該項技術檢測CTC擁有更高的靈敏度、特異性及空間分辨率，SDI-Chip具有一定的選擇性，采用表面具有流體動力優化的免疫涂層微米柱，頻繁的互動及擴展來捕獲CTCs。不同抗原表達水平的CTC可以的有效地被微米柱所捕獲；在血樣中，CTC的捕獲效率大于92％，純度達到了82％，此次研究對象為非轉移的結直腸癌（CRC）患者。

研究者開發的基于流體力學分離與免疫識別的CTC捕獲富集芯片（SDI-Chip）技術，其內構建了成千上萬個表面修飾有抗體的微柱陣列，微柱陣列排布方式根據確定性側向位移分離原理設計，CTC因尺寸較大將沿微柱偏移方向運動并不斷與微柱碰撞而實現特異性識別捕獲，而血細胞因尺寸較小將沿液流方向運動且很少與微柱碰撞而避免非特異性吸附。該設計有效地結合CTC在物理性質及表面標志物與背景細胞的差異，實現了CTC的高效、高純度協同捕獲。通過對大量臨床腫瘤病人外周血樣品的測試，該研究者驗證了所發展的芯片技術在腫瘤分期診斷、療效監控等方面的潛在應用價值。

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SDI-Chip由兩個鏡像一樣的包被上皮細胞粘附分子抗體（EpCAM）的微柱陣列組成，中間有一個樣品入口，并有上下兩個緩沖區入口（圖1）。

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通過計算流體動力學（CFD）用于對不同幾何形狀進行排序，并進一步優化微柱的布置，與圓形和橢圓形微柱相比，三角形微柱提供更高的相互作用概率和較低的剪切應力（圖2）。

為了可視化流動模式和細胞與微柱的相互作用，研究者開發了一個模擬將CFD與固體力學相結合的模型，將不同尺寸的球形顆通過路上的微柱，然后粒泵送到出口，見圖3及視頻1：

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大于臨界直徑（Dc，13μm）的顆粒在與之相互作用的過程中被迫偏轉離并交叉流線于微柱。由于每一列微柱被安排的與上一行偏離，大顆粒不斷與每一個微柱相互作用，導致流動形成了偏斜角。相比之下，小于Dc的粒子仍然以原始流線運行，并減少與微柱的相互作用。模擬結果使用聚苯乙烯（PS）珠證實了實驗觀察到相同的流動模式，見圖4及視頻2：

總體而言，發現了20μm微粒的相互作用概率大于95％，10um微粒相比有顯著提高，相互作用僅有5.5％。結果證明，SDI-Chip可以選擇性地增強大顆粒與微柱相互作用。由于CTC的大小通常大于血細胞，這樣的大小選擇性相互作用可以高效率和高純度的免疫捕獲CTC。

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圖5E.以順時針旋轉一個三角形的微柱，到15o在它的軸線周圍提供了一個更光滑的水動力梯度不影響細胞流動模式的力量。

圖5F. 由于流體的影響，水動力的梯度下降與旋轉的三角形微柱的斜坡相互作用產生增加了粘附力的梯度。因此，每個相互作用，ctc遷移到一個水動力區域減小梯度，致使流速減小，導致與免疫組織微量柱接觸的持續時間延長。

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SDI – Chip進行了傳統軟光刻技術優化，后表面改性，抗體固定化和濃度優化，捕獲芯片的性能驗證使用了EpCAM-陽性SW480懸浮液細胞作為靶細胞（1000細胞/ml），293T細胞（EpCAM-陰性/罕見表達EpCAM）的懸浮液細胞和白細胞（WBCs）（106細胞/ml）作為對照細胞，通過50μm的最佳通道深度和流量為1ml/h的設備進行檢測。

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圖7. (A)表面化學改性和EpCAM抗體固定過程的示意圖。(B)顯微照相熒光標記靶(SW480)細胞在緩沖或血液中分散，對照細胞(293T和WBCs)與免疫球蛋白SDI-Chip的結合。(C)和(D)顯微攝影顯示熒光標記SW480細胞的近視野。(規模:100μm)。

通過在Buffer中摻入SW480細胞，SDI– Chip的捕獲效率為99.2±3.5％，純度為92.4±4.6％（圖8C），同時研究者也展示了SDI芯片的臨床潛力，使用血液樣品進行細胞的捕獲實驗，通過將1000個SW480細胞加入1mL健康血液中來制備供體的血液。平均捕獲效率和純度分別為92.2±6.4％和82.3±3.8％（圖8D）。如此高的捕獲效率和純度是歸因于基于DLD原理的免疫接種相互作用。此外，具有由旋轉提供的流體動力的梯度，在微柱表面上延長接觸時間，三角形微柱也被認為有助于提高捕獲效率。此外，靶細胞等血液細胞流向芯片的空間不同的區域，這可以減少目標細胞的競爭性脫落并確保在高細胞背景下存在高捕獲效率。

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剪切力的流體動力學梯度圍繞旋轉的三角形微柱產生（圖9A）允許根據其抗原來描述捕獲CTC微柱周圍的表達水平。細胞表達較高表面抗原量的CTC形成較強可以抵抗由于剪切而產生的移動力的結合，并且被捕獲在三角形微柱的頂端附近。另一方面，表達細胞表面抗原相對較少量的CTC不會形成足夠強的抵抗力脫落力，因此，他們將沿著斜坡向下移動（較低的剪切應力面積），直到它們形成足夠牢固的粘結以抵抗該地區的流體動力。

捕獲的SW480細胞使用微透鏡觀察使用熒光標記的EpCAM抗體染色的CTC，來評價EpCAM表達水平熒光強度（圖9B）。與低細胞的熒光強度相比，熒光強度較高的細胞被發現被捕獲在剪切應力的區域相對較高。這樣的空間解決捕獲使我們能夠評估在芯片中捕獲的CTC的抗原表達水平，通過觀察CTC圍繞微柱的捕獲位置及抗原進行其他下游分析。

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