摘    要：　在生物化學分析中系統研究樣本與不同濃度組分間的相互作用是至關重要的。微流控芯片技術能夠在微米級的通道內完成精確的液體控制，近年來被普遍應用于生物化學分析領域。微流控濃度梯度芯片是一種能夠快速構建穩定生物化學濃度梯度的工具，能夠與大多數細胞培養、化學分析等技術相結合，為傳統的生化分析提供新平臺。本文綜述微流控濃度梯度芯片的形成機制及其在生物化學等領域的應用，為拓寬濃度梯度相關應用研究提供新思路。

前言

細胞的應激響應與多種生物過程緊密相關，微流控濃度梯度芯片能夠構造與生理環境接近的、具有濃度梯度刺激源的體外微環境，進而揭示生物體對不同生物化學刺激的響應，探究調控細胞生物學行為的決定因素。微流控濃度梯度芯片由于設計靈活易于調節的特點，能夠快速制備穩定的濃度梯度，實現高通量反應。得益于濃度梯度芯片微米級的通道尺寸，能夠將其集成到含有樣品前處理與檢測單元的微流控系統中。生物分子在體內的濃度梯度已經被證實在癌癥轉移、傷口愈合以及生長發育過程中發揮重要作用。基于微流控濃度梯度及芯片細胞培養等技術，有助于實現細胞水平的藥物篩選和趨化性以及毒性分析等研究。本文綜述近3年濃度梯度芯片的開發及其在生物化學領域的應用研究。

 微流控芯片中濃度梯度的形成

1 、微流控濃度梯度芯片的出現

宿主防御、創傷愈合、胚胎發生和癌癥轉移等生物學過程涉及許多可擴散化學物質的濃度梯度[5]。濃度梯度和濃度排列在細胞生物學、趨化因子、生物化學、表面微加工等研究中的作用也日趨重要。傳統上，移液管、凝膠等主要用于稀釋樣品和研究細胞在濃度梯度作用下的行為。然而，這些技術在生成復雜形狀的空間穩定梯度時并不有效。因此，迫切需要一種技術來產生并維持可預測的長期復雜樣品濃度梯度，用于檢測樣品濃度梯度與細胞應答之間的相關性，實現高通量分析（如免疫分析和酶分析）和組合化學的高效多維篩選。早在2000年，Jeon等提出微流控濃度梯度的概念，基于低雷諾數條件下層流擴散混合的原理設計了經典的“圣誕樹模型”且沿用至今，通過控制輸入流體的相對流速，梯度的形狀可以連續改變。這一技術為研究依賴濃度梯度的生物化學現象提供了一個新平臺。近年來，包括層流擴散的微流控網絡在內的多種類型濃度梯度生成芯片被廣泛用于高通量藥物篩選，化學物質毒性分析以及趨化性研究且收獲頗豐。微流控濃度梯度芯片的主要優勢在于能夠通過靈活的通道網絡設計形成不同形狀的濃度梯度，適應需求，且能夠維持濃度梯度的穩定。微流控濃度梯度芯片的發展歷程見圖1。

圖1 微流控濃度梯度芯片的發展歷程

a:Jeon等提出的“圣誕樹模型”濃度梯度芯片；b：改進的手壓式驅動的“圣誕樹模型”濃度梯度芯片;c：基于體積配比混合的新型微流控濃度梯度芯片;d：基于微混合構造的新型微流控濃度梯度芯片設計;e：濃度梯度芯片在藥物篩選中的應用。

2 、微流控濃度梯度芯片的開發

1 、傳統“圣誕樹模型”的發展與改進

多數基于濃度梯度芯片的應用仍舊沿用“圣誕樹模型”，但從芯片的設計制造方面都做出了較大的努力以更適用于特定的應用需求。Chen等采用有限元方法對雙入口及3入口的濃度梯度發生器進行模擬，得到可控的任意近似線性曲線和任意二次方曲線的濃度分布，有助于不同生化樣本中細胞和分子的趨化性研究。類似地，Wang等介紹了采用激光加工微通道的方式制備的一種聚甲基丙烯酸甲酯濃度梯度發生器，可產生近似線性和二次型濃度梯度曲線輸出。為了改進“圣誕樹模型”注射泵進液的方式，Park等提出了一種通過按鈕驅動的微泵單元產生恒定體積的流體驅動樣本，能夠在兩種不同的樣品溶液之間產生6種濃度的線性梯度，該裝置不需要外部泵，更利于其與微型裝置（如96孔板）相集成，且流量可以通過手指按壓進行調整。該裝置通過生成硝基苯磷酸底物的線性濃度梯度實現堿性磷酸酶的檢測。Ebadi等介紹了一種名為樹狀濃度梯度發生器設計工具的軟件設計方法，這對于微加工、光刻和3D打印制造的濃度梯度芯片有很大幫助。通過改變軟件參數即可改變濃度梯度芯片輸出的濃度分布類型，且采用羅丹明-B和食用染料的梯度形成實驗驗證了軟件設計的可靠性。這對于大規模的芯片設計與制造是有益的，能夠提升高通量目標物篩選的效率。

大多數現有的濃度梯度芯片只能在微米大小的尺寸中產生所需的濃度梯度。Rismanian等將改進的圣誕樹模型與一個微混合器相結合，設計了一種能夠在毫米大小尺寸中產生多種試劑（如藥物）的連續濃度梯度的芯片，實驗證明該裝置可以產生兩種試劑的連續濃度梯度，并將它們的所有可能的濃度組合傳遞到毫米大小的樣品。Shimizu等提出了一種基于細胞外基質的梯度發生器，構造了具有由組織流動產生的連續化學濃度梯度的培養表面，利用3D打印水溶性犧牲模具的犧牲成型技術，快速制備了含有梯度發生器和微混合器的明膠基微通道。當熒光染料溶液被引入通道時，微混合器增強了兩種溶液在連接處的混合。此外，通道中產生的濃度梯度通過細胞外基質多孔性質的間隙擴散到器件的培養表面。在表面培養的人臍靜脈內皮細胞對微通道間質流產生的胺濃度梯度做出了收縮反應，這表明該裝置可以用于細胞對化學刺激反應的基礎生物學研究和藥物體外實驗平臺。Hu等介紹了一種低成本的類似圣誕樹模型的濃度梯度芯片，采用熱鍵合聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）技術分別制作了具有2個和3個進口的濃度梯度發生器，該方法可以在不同流速下產生不同的濃度梯度，微通道的結構設計為S形左右對稱，2進口和3進口濃度梯度發生器的濃度梯度分布分別呈近似線性和二次曲線。上述研究進展表明，在經典圣誕樹模型基礎上，針對具體應用對象需要調整濃度梯度生成器的制造工藝、材質以及尺寸等參數，以便適應多場景的應用需求。

為了解決濃度梯度受流速影響的問題，Hoving等設計了一個改進的圣誕樹狀微流控通道網絡，輸入流量可達200μL/min，最大速度約333 mm/s，比現有的報道入口流速高出兩個數量級，極大地擴展了應用領域。類似地，Martin Cabaleiro等報道了采用3D打印樹脂制備了類似圣誕樹濃度梯度發生器。通過限制在連續流梯度發生器下的流速，在到達下一個分叉之前在一個分支中實現完全混合，該濃度梯度生成器在低佩克萊特數下產生梯度的效果良好。此外，該濃度梯度生成器在混合前實現精確試劑量配比，因而生成的濃度梯度形狀與流速無關。

除了利用傳統的微流控芯片材料[聚二甲基硅氧烷（PDMS）、PMMA、玻璃等]，紙基微流控芯片也越來越成為研究熱點。由于梯度的動態形成是基于化學物質在流體中的橫向擴散，在紙通道中分子的橫向流動主要受機械擴散控制，這與分子擴散有本質區別，因此，在紙上設計梯度發生器需要不同于傳統微流體中使用的策略。Schaumburg等利用計算機模擬研究紙基微流控濃度梯度發生器的優化設計，討論Whatman濾紙濃度梯度芯片的設計與制備，建立了二維平面紙和三維垂直紙兩種新的金字塔網絡模型。在紙和類似多孔基質中適當地利用機械擴散會給紙基濃度梯度芯片帶來巨大潛力。

2、 新型微流控濃度梯度芯片開發

經典的“圣誕樹模型”原理簡單，因易于操作而具有廣泛應用，然而其也存在通道冗長、梯度形成時間長、梯度易受流速影響等缺點，因此，為克服上述問題，越來越多的新型濃度梯度的設計被報道。Futai等開發了一種包含窄微通道的濃度梯度生成芯片，該窄通道具有適當的流阻，既能滿足試驗物質的快速引入，又能長期保持梯度。該芯片能夠保持Alexa螢石熒光染料濃度梯度至少48 h。生成和維持長期穩定的梯度是當前微制造系統的一個挑戰。Parittotokkaporn等開發了一個簡單的流體驅動微流控系統，芯片采用聚二甲基硅氧烷材質通過標準軟光刻技術制備而成，在1～10μL/h低流量控制下產生熒光染料梯度，梯度在1 h內形成，在2 h～5 d內能夠保持穩定。Shi等通過將4組進樣口（樣品和緩沖液）依次連接到主通道，確定進樣口的位置和層流類型，建立濃度梯度。由于樣本比例被事先分配好，因而濃度梯度的產生只需要將樣本充分混合即可，而不受入口流速的影響。從主通道引出9個微混合通道，以有效地混合層流。將方波結構與微通道側壁槽相結合，設計了一種比傳統蛇形混合通道混合指數更高的微混合通道。在流速為2 280μL/min情況下，按照快速微混合原理，線性濃度梯度可在數秒內實現，且梯度形狀與流速無關。

具有理想梯度的表面已被證明是一種強大的工具。Zhou等展示了一種新型的微流控網絡，可以在微流控通道內建立濃度梯度進行表面聚合或化學沉積，從而實現聚二甲基硅氧烷基底上穩定的特征梯度。該芯片可用于制備底物在蛋白質吸附和納米粒子固定化等多個領域，實現生化分析與傳感的實際應用。此外，Hong等提出了一種用于復雜網絡拓撲結構微流控濃度梯度發生器反設計的深度神經網絡模型。該方法將濃度梯度和產生濃度梯度的設計參數分別作為深度神經網絡的輸入和輸出，并映射它們之間的關系。此外，他們提出了一種基于替代優化和自適應采樣的微流控濃度梯度發生器設計方法，以滿足規定的濃度梯度。在許多生化實驗中，控制特定位置的濃度梯度是至關重要的。Liu等基于聚二甲基硅氧烷的透氣性，提出了一種可調濃度梯度發生器，該發生器由氣泡通道中的聲學振蕩氣泡驅動，位置可控。濃度梯度的調節可以通過改變氣泡的數量和位置來實現。該器件制作簡單、反應靈敏、生物相容性好，特別適用于對時間可控性要求較高的生物學研究。

微流控濃度梯度芯片的應用

1 、高通量藥物篩選

微流控濃度梯度芯片由于可以在芯片內部建立起穩定的濃度梯度，且可以與3D細胞培養技術相結合，因此越來越受到關注，被廣泛地用于細胞水平的藥物篩選研究。3D細胞培養在模擬體內腫瘤的結構和生理條件方面被認為更具臨床意義。Lim等開發了一種帶有細胞培養裝置的微流控濃度梯度發生器，可以使細胞形成球狀體并在腫瘤藥物梯度存在的情況下生長。當結腸癌細胞成一個單一的球狀體，球狀體在癌癥藥物梯度伊立替康的存在下培養3 d，球狀體的數量、圓度和細胞存活率與藥物濃度成反比。這些結果表明帶有細胞培養裝置的藥物濃度梯度芯片有可能成為篩選腫瘤藥物療效的平臺。2型糖尿病藥物篩選的體外模型對制藥業至關重要。Luo等研制了一種基于微流控技術的環形藥物濃度梯度芯片，并集成了胰島素瘤細胞系的3D培養。在高濃度葡萄糖作用下細胞的增殖，先是促進后抑制，胰島素分泌功能也在高濃度葡萄糖作用下先增強后抑制。這個模型可以幫助找到刺激胰島素分泌的藥物。Shen等開發了一種簡單緊湊的微流控芯片，可以在大流量范圍內快速構建多種溶質的3個濃度梯度，生成的3個穩定、準確、可控的藥物梯度可以評價對兩種腫瘤細胞系（MCF-7和Hep G2）的治療效果。

抗生素的最低抑菌濃度是確定抗生素的藥劑和抑制細菌生長的最小劑量的有效值。Tang等提出了一種基于離心微流控的高度自動化線性濃度梯度發生器，該裝置進行了抗菌藥物藥敏試驗。采用線性濃度梯度生成一系列濃度的氨芐青霉素，自動與大腸桿菌混合，通過測定懸浮液的光譜吸光度，確定氨芐青霉素對大腸桿菌的最低抑菌濃度值。類似地，Shi等成功地利用研制的微流控濃度梯度芯片實現了抗菌藥物頭孢唑肟對大腸桿菌的最低抑菌濃度的篩選。Zhang等利用濃度梯度芯片用于細菌快速生長和抑菌試驗，可以在芯片上定量測定阿莫西林抑制細菌的生長情況，以較低的細菌初始濃度在6 h內獲得最低抑菌濃度值。此外，梯度條件下微流控芯片細胞存活率與傳統培養實驗存活率呈線性關系。基于微流控濃度梯度芯片的藥物篩選有利于個性化醫療新方法的開發。

2 、化學毒性分析

微流控濃度梯度芯片能夠用于生成化學刺激因子的濃度梯度，利用受試物的響應評價化學刺激因子的毒性。Bagheri等采用微流控濃度梯度生成器進行碳量子點對單細胞真核模型生物酵母菌畢赤酵母的毒性分析，酵母細胞增殖的生長抑制和各種芽殖細胞形態的變化與碳量子點的濃度相關。研究表明微流控梯度生成器有潛力作為一種細胞水平上評估納米材料毒性的工具。類似地，Park等利用梯度發生器與3D體外細胞培養模擬體內微環境，用于檢測感染尤文氏肉瘤細胞的細胞毒性。Zhang等描述了一種化學梯度生成器輔助微流體細胞系統，用于在通量方式下動態研究典型環境污染物誘導的支氣管上皮細胞損傷，結果證明微流控系統在精確和長期化學梯度生產中具有較高的穩定性和可靠性，對支氣管的靜脈曲張炎癥和細胞毒性反應進行了實時監測和測量，苯并芘定向引導支氣管上皮細胞出現明顯的細胞萎縮，提示其對呼吸系統有明顯的炎癥和細胞毒性作用。基于微流控濃度梯度生成芯片的化學梯度通過與模式生物相互作用，結合多種形式的芯片檢測技術（如表面增強拉曼光譜），能夠在環境監測和藥物開發等領域有潛在的應用前景。

3、 趨化性研究

趨化性是細胞在化學梯度作用下，向上或向下移動以響應引誘劑或驅避劑的過程，是細胞對環境變化反應的一個主要因素。采用濃度梯度芯片有利于實現模式生物趨化行為的定量分析。Wang等首次將濃度梯度芯片與微藻處理檢測系統相結合，用于快速評估壓載水化學處理的有效性，篩選處理的最佳時間以及試劑濃度。濃度梯度芯片可以快速生成所需的任何濃度，對微藻細胞進行驅離，同時用葉綠素的平均熒光強度檢測微藻的去除效果。類似地，Wang等提出了一種包含微藻細胞分離、處理和生存能力表征的微流控系統，能夠快速有效地識別和分離微藻細胞，利用濃度梯度發生器，自動生成具有梯度濃度的化學試劑，篩選最佳的微藻驅離濃度。基于濃度梯度發生器和細胞檢測技術，能夠針對包括海洋模式生物在內的細胞進行趨化性研究，有利于在生態環境保護等分析領域的新應用。

4 、材料合成

微流控濃度梯度芯片還能夠利用自身的優勢同時形成多種材料制備的條件，在生物材料及納米材料制備等方面有所幫助。Li等設計了一種簡單的三重梯度微流控芯片，用于高效篩選化學空間。該裝置的篩選效率有數量級的提高，該裝置篩選了溶菌酶和胰蛋白酶兩種模型蛋白的結晶條件，并用X射線衍射證實了晶體結構。Liu等設計一種簡單可控的方法，通過結合液滴產生和梯度發生器，同時制備4種不同類型的微粒子，通過操縱聚（乳酸-二羥乙酸）濃度梯度、聚（癸內酯）/聚（乳酸-二羥乙酸）比例梯度和碳酸二甲酯/二氯甲烷比例梯度，可以產生不同大小、異質性和各向異性的微粒子。因此，基于微流控濃度梯度芯片的材料合成條件的篩選也逐漸成為其新的應用領域，能夠廣泛地用于材料合成和化學篩選、給藥制劑、生物檢測鑒別、微傳感器和組織工程等領域。

展望

濃度梯度芯片是微流控芯片技術的一個重要分支。研究者通過優化經典的“圣誕樹”模型以及開發全新的濃度梯度芯片，能夠實現不受入口流速影響的濃度梯度，通過修改設計參數實現特定的梯度形狀并維持數天的穩定，通過改進加工工藝以及材料，能夠適用于多場景下的應用需求。得益于微流控濃度梯度芯片設計靈活、梯度穩定以及與多種檢測技術相結合的優勢，在腫瘤藥物篩選、抗生素最低抑菌濃度篩選、藥物開發、毒性分析，趨化性研究以及材料合成等領域得到充分應用。針對特定應用需求（如生物檢測，基于可穿戴式設備的個性化醫療等），開發新型的濃度梯度芯片將是后續發展的熱點。

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