微流控芯片系統(tǒng)由于分析速度快、試劑消耗少、便于集成和高通量分析等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于生化分析等各領(lǐng)域.過去20年中，伴隨材料科學(xué)的發(fā)展以及利用微加工技術(shù)操縱小尺度微流體的實現(xiàn)，微流控芯片技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步，目前，基于細(xì)胞、組織培養(yǎng)的微流控芯片系統(tǒng)已應(yīng)用到高通量篩選、藥物開發(fā)及毒性測試等領(lǐng)域，未來還可將其應(yīng)用到再生醫(yī)學(xué)等相關(guān)技術(shù)中.

水凝膠是一種三維親水性網(wǎng)絡(luò)狀聚合物，因其具有高含水量及靈活多變的柔性結(jié)構(gòu)，并易于模擬活體組織而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域.聚乙二醇PEG)基水凝膠材料的生物相容性好、免疫原性低且可操控性強(qiáng)，可通過物理或化學(xué)交聯(lián)的方法得到不同結(jié)構(gòu)和功能的水凝膠，其中PEG丙烯酸酯類衍生物因具有較好的光聚合性能而成為最常用的PEG基水凝膠前體"”.在光引發(fā)劑和紫外光作用下，聚乙二醇雙丙烯酸酯能在室溫下迅速聚合成PEGDA水凝膠，反應(yīng)時間短、成型快且耗能低·此外，紫外光聚合反應(yīng)可實現(xiàn)空間與時間上的可控，形成結(jié)構(gòu)多樣的水凝膠，不僅可以作為藥物載體或組織修復(fù)與再生的細(xì)胞支架材料，還可作為構(gòu)建微流控芯片細(xì)胞培養(yǎng)平臺的基質(zhì)材料.我們利用PEGDA水凝膠材料的上述優(yōu)點，將其用于構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)及檢測的微流控芯片，通過紫外光聚合反應(yīng)直接加工具有不同微結(jié)構(gòu)的適于細(xì)胞培養(yǎng)及檢測的雙層水凝膠微流控芯片，建立了一種快速、高效且低成本的水凝膠微流控芯片加工方法.結(jié)合自主研發(fā)的卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)，實現(xiàn)了芯片細(xì)胞培養(yǎng)平臺上的細(xì)胞代謝指紋快速可視化傳感檢測.

芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)

將制作好的芯片置于75%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇中浸泡1h，再用紫外燈照射1h進(jìn)行滅菌外理.將消毒后的芯片在無菌PBS緩沖溶液中漂洗，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)液中浸泡.將芯片置于37℃、5%CO?(體積分?jǐn)?shù))的培養(yǎng)箱中孵育24h，再接種細(xì)胞懸液.用微量移液器將細(xì)胞懸液從芯片入口處緩慢接種至芯片中，細(xì)胞接種密度為2x10°cells/mL.靜置片刻后，再從入口處緩慢灌注培養(yǎng)液，使未被微井捕獲的細(xì)胞從出口處移出·將芯片置于培養(yǎng)皿內(nèi)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后更換新鮮培養(yǎng)基，此后以灌流的方式為芯片上所培養(yǎng)的細(xì)胞換液，并收集出口處的代謝液.

腫瘤細(xì)胞代謝指紋可視化傳感檢測

通過標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)過程，在芯片上分別培養(yǎng)HepG2人肝癌細(xì)胞、MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞并收集其代謝液.采用我們自主研發(fā)的卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞代謝液進(jìn)行檢測.該傳感器系統(tǒng)以卟啉及其衍生物和特異性染料作為傳感單元，傳感單元具有交叉敏感響應(yīng)，每個傳感單元對不同代謝組分具有不同的響應(yīng)能力，通過模式識別的方法對代謝物進(jìn)行識別，實現(xiàn)對細(xì)胞的整體代謝特征響應(yīng)并得到特征代謝指紋圖譜，從而實現(xiàn)對代謝物的區(qū)分檢測，其檢測過程如圖2所示，通過采集傳感陣列與細(xì)胞代謝液反應(yīng)前后的可見光區(qū)陣列光譜圖，系統(tǒng)軟件自動提取并保存陣列上每個點的紅R，綠G)和藍(lán)B)數(shù)值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到反應(yīng)前后的陣列響應(yīng)紅綠藍(lán)RGB差譜圖，通過軟件分析可實現(xiàn)對目標(biāo)物的識別.

芯片上的細(xì)胞捕獲與培養(yǎng)

細(xì)胞在芯片內(nèi)的分布通過芯片中的3x15微井陣列捕獲細(xì)胞來實現(xiàn).細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)腔后，隨著微流體的流動通過重力作用而被微井結(jié)構(gòu)捕獲，并固定在微井結(jié)構(gòu)中，未被捕獲的細(xì)胞則隨著流體從出口處移出，這樣的微井陣列結(jié)構(gòu)可有效控制細(xì)胞的分布，以便觀察和分析.當(dāng)一個微井結(jié)構(gòu)布滿細(xì)胞后，細(xì)胞將流向下一個微井，使細(xì)胞均勻分布在每個微井結(jié)構(gòu)中，與常規(guī)培養(yǎng)方式相比可有效提高細(xì)胞分析的準(zhǔn)確性和可信度.圖4為細(xì)胞進(jìn)樣前后顯微鏡下的微井結(jié)構(gòu)圖，圖4A)顯示微井結(jié)構(gòu)邊緣光滑整齊、分辨率高;圖4B)顯示細(xì)胞進(jìn)樣后被微井結(jié)構(gòu)所捕獲，均勻分布在各個微井結(jié)構(gòu)中.重復(fù)性及平行性實驗表明，該微井結(jié)構(gòu)對細(xì)胞具有很好的捕獲能力，并且水凝膠材料可以很好地模擬組織細(xì)胞生長的微環(huán)境，細(xì)胞在微井中生長狀況良好，細(xì)胞活性強(qiáng).

腫瘤細(xì)胞代謝指紋檢測

收集HepG2人肝癌細(xì)胞、MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞3種腫瘤細(xì)胞代謝液，用卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)對其進(jìn)行檢測，所得可視指紋圖譜如圖5所示.由圖5可見，傳感陣列對腫瘤細(xì)胞代謝物具有顯著的響應(yīng)，且對不同腫瘤細(xì)胞的響應(yīng)結(jié)果不同，說明每種腫瘤細(xì)胞均具有各自特異的代謝指紋圖譜，用目視的方法即可區(qū)分.對3種腫瘤細(xì)胞代謝液檢測的RGB差譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析HCA及主成分分析PCA，結(jié)果如圖6所示.由HCA分析圖可見，聚類效果明顯，每種腫瘤細(xì)胞的5組平行樣各自匯聚在一起，能較好地識別和區(qū)分3種腫瘤細(xì)胞;并且同種腫瘤細(xì)胞的5組平行樣間聚類較近，說明實驗具有相對穩(wěn)定的重復(fù)性。而通過主成分分析圖，在由前三維主成分為軸的立體空間內(nèi)，同種細(xì)胞很好地團(tuán)簇在一起.卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)能夠有效識別不同種類腫瘤細(xì)胞的整體代謝特征，以水凝膠微流控芯片為細(xì)胞培養(yǎng)、檢測平臺并結(jié)合卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)可實現(xiàn)對細(xì)胞代謝情況的快速檢測與區(qū)分.利用 PEG基水凝膠材料的紫外光聚合性能，通過掩模選擇性地聚合水凝膠材料，設(shè)計并制作了用于細(xì)胞培養(yǎng)及檢測的雙層水凝膠微流控芯片·顯微觀察及生物學(xué)代謝檢測實驗結(jié)果表明，該芯片的微井結(jié)構(gòu)對細(xì)胞具有高效的捕獲與培養(yǎng)能力，且能夠有效控制細(xì)胞在芯片內(nèi)的空間分布.PEG基水凝膠微流控芯片的制作工序簡單，加工成本低，且易于對水凝膠材料進(jìn)行各種修飾以模擬組織細(xì)胞生長的微環(huán)境，非常適用于細(xì)胞生物學(xué)研究.將其與卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)結(jié)合使用，可實現(xiàn)芯片細(xì)胞培養(yǎng)平臺上的細(xì)胞代謝指紋快速可視化傳感檢測.

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