微流控芯片在生物醫學領域中的一些應用
從微流控芯片的分析性能看,其未來的應用領域將十分廣泛,并且其應用領域仍在不斷地拓展之中,但目前的重點顯然是在生物醫學領域。除此之外,高通量藥物合成與篩選、環境監測、食品衛生、刑事科學及國防等方面也會成為重要的應用領域。現僅就微流控芯片在生物醫學領域的應用舉三個例子說明微流控芯片系統的巨大潛力:
1. 毛細管電泳分離
毛細管電泳芯片是微流控芯片中發展最早、也是發展最快的一項芯片技術,目前已經成為微流控芯片領域中最令人矚目的一個分支,與傳統的毛細管電泳相比,它具有自動化程度高、樣品消耗少、分析速度快以及高通量等特征,在對DNA片段、多肽、蛋白質等生物大分子的分析中,它表現出了超強的分離分析能力,它被認為是后基因時代中最有希望攻克蛋白質研究、基因臨床診斷等科學難題的分離分析手段之一。1992年Manz A發表了第一篇有關毛細管電泳芯片的論文,該文以熒光染料為分析對象,以電滲流作為流體驅動力,在芯片微流體網絡中成功地實現了流體控制,向人們展示了毛細管電泳芯片的雛形和其優越的分離分析能力,這一研究成果引起了學術界的廣泛關注和興趣,相繼各種用于氨基酸、蛋白質、藥物等分離的芯片也不斷開發成功。為了進一步提高芯片的分析能力,Mathies領導的研究小組最近在直徑為200mm的圓盤玻璃芯片上集成384個毛細管電泳微通道,其有效分離長度達到了8cm,對100bp(base pair,堿基對)~1000bp的基因標準標記物達到了優于10bp的分辨率,并在該芯片上完成了1163D變異基因的PCR-RFLP(限制性片斷長度多態性)分析,為臨床診斷提供了依據。我們實驗室研制出了一種新型結構的PDMS電泳微芯片,并已經在自行研制的LIF檢測系統上完成了對氨基酸、PCR markers(標記物)的電泳分離,臨床應用實驗也正在進行之中。
毛細管電泳微芯片是微流控分析芯片中產業化程度最高、也是最先實現商品化的一類芯片,早在1999年,美國惠普(現為安捷倫)與Caliper Tech-nologies公司聯合研制的第一臺微流控芯片商品“2100生化分析儀”就已經開始投放市場,該系統使用CAliper公司生產的玻璃芯片,采用LIF進行檢測,并配了5~6種試劑盒配合使用,可對DNA、RNA片段及蛋白質等進行電泳分離檢測,玻璃芯片尺寸為1.8cm×1.8cm,有效分離長度約1.6cm,30min可同時完成12個樣的分離檢測。與傳統的基因和蛋白質電泳相比,芯片毛細管電泳無需樣品的走膠、染色、脫色工序,無需干燥和照相等煩瑣耗時的步驟,同時快速測試多個試樣,獲得基因和蛋白質的電泳圖和曲線。整個測試過程簡化為快速、簡易的三個步驟:裝載樣品、進行分析、觀察數據。
2. 基因測序
毛細管電泳的一個重要應用領域是基因測序,正是因為96根毛細管電泳陣列儀廣泛地應用于人類基因組計劃的測序工作之中,才使舉世矚目的人類基因組計劃的進程大大加快,使之由原定的2003年提前到2000年基本完成。事實上,從基因測序的原理來講,芯片毛細管電泳測序和普通毛細管電泳測序是完全一致的,但前者表現出了更大的優越性:首先由于芯片毛細管電泳獨特的注樣方式和更細的分離通道,所以它能實現DNA的快速分離;另一方面微流控芯片采用了半導體工業中成熟的微加工技術進行制造,所以一塊芯片上可以集成更多的毛細管,實現高通量測序;最后由于它實現了產物處理和分析的集成化,減少了人為干擾,因此更進一步地降低了操作成本。
Mathies領導的研究小組早在1995年就開始在微流控芯片上開展了DNA測序工作,他們在一塊有效分離長度為3.5cm的芯片上測序了150個堿基,他們利用芯片變性毛細管電泳在10min之內就完成了對433個堿基序列的測定。該測序芯片的毛細管長度為3.5cm,橫切面尺寸50μm×8μm。為了進一步提高DNA測序能力,到2001年他們在直徑為150mm的圓形玻璃芯片上,刻蝕出了96個呈輻射型排布的毛細管電泳通道陣列,由于芯片采用旋轉掃描LIF法進行檢測,所以可實現平行測序,測序達500堿基。
3. PCR反應
生化反應芯片的功能就是把在普通實驗室中進行的生化反應實驗縮微到一塊小小的芯片上來完成。目前報道的生化反應芯片主要包括聚合酶鏈反應(Polymerize Chain Reaction,PCR)芯片、藥物合成芯片等,其中PCR芯片是生化反應芯片的典型代表。眾所周知,常規PCR需要制樣、擴增及檢測等步驟,既費時又費力,而當用微流控芯片進行PCR擴增及相關檢測時,則可大大簡化操作步驟、顯著提高檢測效率。1993年Northrup等人以硅片和玻璃為基質材料首次報道了一種PCR芯片,并通過實驗證明了PCR芯片可行性。該芯片的反應室刻蝕在硅片中,體積約為幾微升,加熱器也直接集成在芯片上,與傳統的PCR相比,在相同擴增效率下,該芯片的熱循環效率快2~ 10倍。我們實驗室利用MEMS技術在硅片上研制出了一種PCR芯片,并實現了PCR擴增反應,芯片加熱器和溫度傳感器都全部集成在芯片上,該芯片的最大升溫速度是15℃/s,降溫速度為15℃/s,為了使芯片系統達到智能化控制的目的,我們還開發出了相應的熱循環控制器,實物圖如圖2所示。為了進一步提高PCR芯片的熱循環速度,Kopp M U等人發展了一種連續流動式的PCR芯片,流動式芯片下面有95℃、72℃、60℃三個不同的恒溫區間,當樣品流經它們時就會實現自動變溫,在流動中完成變性、退火和延伸反應,達到PCR擴增的目的。
另外,一旦把PCR芯片與毛細管電泳芯片二者集成起來的時候,其優勢就顯得更為明顯。Lagally E T等人在玻璃芯片上制作了集閥門、疏水孔、PCR反應池以及毛細管電泳(Capillary Elec-trophoresis,CE)于一體的芯片系統,PCR反應池體積是280nL,PCR擴增前所需模板濃度為20拷貝/mL,反應室中平均僅為5~6個DNA模板分子,加熱器和熱電偶集成在芯片的背面,10min即可完成20個循環。反應完成后,PCR反應產物在電滲泵的驅動下進入毛細管電泳芯片中,進行在線CE分離分析。該芯片系統集取樣、PCR擴增和CE分離于一體,節省了試劑消耗、加快了分析速度,同時也避免了實驗操作中的人為污染。
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