利用微流控技術進行主動式細胞分選的方法
利用微流控技術進行主動式細胞分選的方法是在微流控裝置上通過采集不同細胞所帶有的特征信號,借助外力進行分選。
1.熒光激活細胞分類術分選法
熒光激活細胞分類術(fluorescence-activatedcellsorter,FACS)或流式細胞分析術由于其本身具有的靈敏度高、高通量、技術發展成熟等特點已經成為許多生物學家進行細胞分選的首選方法。FACS的原理是通過壓力驅動和鞘液夾流等技術實現樣品聚焦,使經特異性熒光染色的目標細胞所制成的單細胞懸液呈單粒子排列,進入檢測區域,檢測器按照其產生的散射光和激發熒光信號的不同進行識別與記錄,進而據其特性施以外力操控,實現細胞分選[4]。通常,由帶有熒光分子標記的特異性抗體來對細胞表面的標記物進行識別。自從Fu等[5]將FACS與微流控設備結合,用于分選細胞以來,各種驅動力與微流控–流式細胞儀的組合應運而生,包括流體力驅動[6]、電滲力驅動[7]、靜電力驅動[8]、動電力驅動[9]、介電電泳驅動[10]等。Krivacic等[11]運用該技術,在微流控芯片上以3×104/s細胞的高速實現了對癌細胞高純度分選。Cho等[12]也使用微流控–流式細胞儀成功實現了對人類哺乳動物細胞的高純度富集與分選,富集濃度達到230倍。
在微流控芯片上運用FACS完成細胞分選的優勢:(1)靈敏性高,能夠在單個細胞水平上實現細胞的逐一分離;(2)精準度高,細胞逐個通過檢測器后被精確分類而得以分選;(3)應用廣泛,涉及的被分類物質種類廣泛,可用于多種細胞的分選。但其缺陷在于:設備昂貴,微通道易阻塞,樣品易污染,分離的連續性無法保證,在檢測、分離過程中細胞受到的撞擊力大,導致細胞最終的存活率不高。這些缺陷有待進一步研究與改善。
2.磁操控分選法
在微流控芯片上運用磁操控分選法進行細胞分選篩選簡便易行,易于作為前處理部分集成再用于細胞分析的微流控芯片上。磁操控分選法的高特異性與高效性使其在細胞分選方面具有相當大的優勢。免疫磁分選技術和高梯度磁分選技術是目前微流控芯片磁操控細胞分選主要應用的方法。
免疫磁分選技術
該技術中細胞的分選是基于目的細胞表面的獨特抗原與免疫磁性微球(或免疫磁珠)上的特異性抗體通過抗原抗體反應結合,在外加磁場作用下,僅與免疫磁珠結合的目的細胞被滯留在磁場中,無法與免疫磁珠結合的成分則被濾去,從而達到分離靶細胞的目的。在微流控芯片上利用免疫磁分選技術所分離出的目的細胞可直接用于后續的分析與檢測,從而簡化了操作步驟,提高了效率,便于連續化、集成化、自動化的實現。Kim等[13]利用C2A蛋白標記的磁珠,在微流控芯片上運用免疫磁分選技術,成功地使細胞懸液中的Jurkat凋亡細胞獲得高效分離。Forbes等[14]在微流控裝置上運用免疫磁分選技術,實現了對磁標記乳腺癌mcf7細胞的高純度分離,大大提高了臨床診斷的準確性。
高梯度磁分選技術
20世紀60年代后期開始發展起來的高梯度磁分選技術(highgradient magneticseparation,HGMS),主要用于分離磁性極弱的微粒,例如直徑在100nm以內的順磁性或逆磁性微粒。高梯度磁分選系統通常由填充有易磁化超細金屬絲的柱形過濾器和電磁場組成,金屬絲在電磁場的作用下產生磁場梯度,使處于該區域的己被磁化了的目的微粒被梯度磁力吸引而固定,而樣品中的其他非磁性成分則不會在該區域滯留,從而實現目的微粒的分選。Adams等[15]制作了一個微流控芯片連續高梯度磁泳分選器,運用高梯度磁分選技術實現了對目標細胞的的連續快速高純度分離。夏恒[16]利用相關軟件,通過仿真模擬,將微通道的構型做了優化與改進,在微流控裝置上實現了磁泳連續高效細胞分選。
微流控芯片上的磁操控分選法具有如下優勢:(1)分選速度快、效率高、重復性好;(2)操作簡單、無需昂貴的儀器設備,便于實現高通量、自動化;(3)分離過程無毒無污染,并可同時產生富集、純化效果;(4)被分離細胞的存活率高,且生物學性狀與功能不受影響。但是,目的細胞上獨特抗原的特異性抗體的篩選是該技術的重點與難點,是制約該技術推廣使用的瓶頸。
3.雙向電泳分選法
雙向電泳(dielectrophoresis,DEP),又稱介電電泳,是微流控芯片上較常采用的細胞分選法,該方法利用芯片上的交流電場將樣品溶液中的目的細胞分離,可利用細胞大小不同,同時完成對細胞的濃縮、操控和分選,是一種高效率且高選擇性的方法。其原理是細胞在高頻電場作用下產生極化,因介電特性、電導率和形狀不同,不同種類細胞感應出不同的偶電極,從而受到不同的介電力,致使它們以不同速率向電場的正極或負極定向移動,從而在電場中實現分離。Gascoyne等[17]使用雙向電泳–場流分級(dielectrophoresis-field-flow-fractionation,DEP-FFF)技術成功的從患者血液中分離出了感染瘧原蟲后的病態紅細胞。由于紅細胞感染瘧原蟲后,細胞膜表面蛋白發生改變,因此病態細胞等電點與正常細胞存在差異,在正旋交流電的作用下,病態紅細胞以異常的泳動速度在微通道分離腔中實現分選。Zhu等[18]采用雙向電泳技術,在微流控芯片上實現了對直徑在4~8μm的酵母細胞的連續高效分選。
在微流控芯片上利用雙向電泳技術可對細胞直接進行無接觸的選擇性操控、定位與分選,無需特異性細胞標記或修飾,外圍設備簡單,操作簡便。但是生物細胞在電場中存活率較低,且該方法特異性較差,對于介電特性、電導率、形狀等性質相似的細胞無法實現精確分離。
4.光學鑷子分選法
在微流控裝置上運用光學鑷子分選法操控細胞分離時,由于光獨特的光學極化效應,無需接觸待分離的細胞,因而避免了機械接觸所造成的污染與損傷,大大提高了分選后細胞的存活率,該技術已受到越來越多研究者的關注。光學鑷子分選法主要根據目的細胞的大小和折射指數,在光干涉測量模式下,激光聚集可形成光阱,微小物體受光壓而被束縛在光阱處,移動光束使微小物體隨光阱移動,借此可對目的細胞進行捕獲與分選[19]。捕獲束的控制位置位于兩個單纖維之間的微球上,微球的位置決定兩纖維間的耦合程度,并決定光在二者間是聚焦還是偏斜,進而將產生的光信號與微通道內的電解質顆粒偶聯,最終通過電場梯度截獲電解質顆粒而捕獲靶細胞。Wang等[20]利用光學鑷子分選技術,在微流控芯片上分別實現了對酵母細胞和人類胚胎干細胞的操控與分離。
雖然,該技術的效率與FACS等相比仍較低,但其優勢在于靈敏度極高,即使細胞間相互作用后產生的形變極其微小也可改變光的狀態,進而通過光信號實現細胞分選。Chiou等[21]對細胞間相互作用及聚焦激光束進行深入研究后,對微流控裝置加以改進,從而實現了高通量進樣,大大提高了分選效率。
5.超聲波分選法
利用超聲波輻射力對懸液中的粒子進行分離提取,已被廣泛應用于傳統的化學工程與材料科學領域。超聲波分選技術是利用超聲波輻射力所具有的空化效應、機械效應、熱效應,以及超聲空化過程中氣泡的劇烈變化所產生的附加湍動效應、界面效應、聚能效應等,通過提高傳質系數,增大介質分子的運動速度,增強介質的穿透力以強化分離過程[22]。由壓電材料在微通道中引發的超聲共振效應可以產生超聲波輻射力,從而產生上述效應,當細胞以流體的形式在微通道內移動時,不同直徑、密度、可壓縮性的細胞在上述多種效應的作用下,會產生不同的遷移率,進而可根據通過檢測窗的先后順序,完成細胞在微流控芯片上的分選。Petersson等[23]利用該原理,在微流控芯片上以自由流體聲波電泳的方式,完成了對直徑在2~10μm之間的粒子的分選,并將該技術應用于醫學領域,實現了對血液中紅細胞、白細胞、血小板的連續高效分選。該技術在應用過程中,細胞于超聲波輻射力的作用下能否存活成為許多研究者關注的問題。Evander等[24]研究了細胞在超聲共振效應中所受到的力以及微通道中溫度升高的幅度,實現了對神經干細胞的高存活率分離,得到的目的細胞在微通道中可以存活十五分鐘以上。
該技術分選效率較高,無需復雜的大型設備,但對設備材質的要求較高,價格昂貴,對操作人員的專業素質要求也較為苛刻,不利于推廣使用。