體內組織細胞在體外培養時，所需培養環境基本相似，但由于物種、個體遺傳背 景及所處發育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養技術措施 亦不盡相同，現介紹個別組織細胞培養的要點如下:

第一節 上皮細胞培養

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于 上皮組織，故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中?；祀s有成纖維細 胞，培養時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外 長期生存，因此純化和延長生存時間是培養關鍵。 體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜， 因此培養在有膠原的底物上可能利于生長， 另外人或小鼠表皮細胞培養在以 3T3 細胞為飼養層（用射線照射后）時，細胞易 生長并可發生一定程度的分化現象。降低 PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加 入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。 以表皮細胞為例， 用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞， 其法如下 （黑 木凳志夫 1981） 

1、 取材： 外科植皮或手術殘余皮膚小塊， 早產流產兒皮膚更好， 取角化層薄者， 切成 0.5－1 平方厘米小塊。 

2、置 0.02%EDTA 中，室溫，5 分鐘。 

3、換入 0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。 

4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。 

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置 0.25%胰酶中，37℃，30—60 分鐘。 

6、反復吹打，制成懸液。 

7、培養：用 80 目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸去上清。 

8、直接加入培養基（Eagle 加 20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2 溫箱培養。

第二節 內皮細胞培養

內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞，對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血 管生長因子（TAF）等有很大價值。 研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，其法如下： 

1、產后新鮮臍帶，無菌剪取 10—15 厘米長一段，如不能立即培養，可于 12 小 時內保存于 4℃。 

2、用三通注射器吸取溫 PBS 液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊， 以防液體返流。 

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為 0.1%的粗制 膠原酶，充滿血管，消化 3—10 分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。 

4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫 PBS 輕輕反復沖洗后，一 并注入離心管中（此步驟可重復） 。

5、離心去上清，加入 RPMI1640 培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫 箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。

第三節 神經細胞培養

神經細胞（神經元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加 入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現一定程度的分化，長出突起等現象， 但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。 人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可 形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質細胞在培養中生長不穩定，不易自 發轉化， 但對外界因素仍保持很好的敏感性， 可用 ROUS 病毒和 SV4 等誘發轉化。 設備： 無菌操作設備。 

一、設備 培養箱：恒溫 5%、10%CO2 維持培養液中 pH 值。 

二、大型設備 CO2 培養箱 倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況。 解剖顯微鏡，用于準確地取材。 常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。 低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。 電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。 高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術器械。 過濾器：配制解剖液、培養液，必須過濾后才可使用，以去除細菌。 滲透壓儀，pH 劑，天平等。 

三、培養器皿及手術器械 1、培養皿：常用 35mm 塑料及玻璃皿，解剖取材用 15mm-90mm 直徑。 2、培養板，24-40 孔，可用于開放培養。 3、培養瓶： 4、吸管，常用 1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。 5、各類培養液貯存器。 6、小型手術器械。 

準備： 

一、配制培養液 解剖液： （1）解剖液：以無機鹽（去除 Ca2+ , Mg2+）加葡萄糖配制成 PBS 緩沖液，保 持一定的滲透壓和 pH 值。 基礎培養基（MEM） ：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。 （2）基礎培養基（MEM） ： 接種培養液： （3）接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為 MEM 含 1%谷氨酰胺，另加入 10%馬血清，當天配制。 維持培養液：接種后 24h，全部換成此液，后每 2 周換一次，每次換 1/2。 （4）維持培養液 其成分為 MEM 中含 5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養物質。 

二、培養基質 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠 消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗 2-3d，達兩次 ddH2O，每遍 三、消毒培養皿的備用 洗刷 3-4 次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前 1 天進行。 神經細胞分散培養 

（一）選材 常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡 6-8d，新生鼠或胎 鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以 19d 為宜， 小鼠以 18d 為宜，大鼠紋狀體以 10d 為宜；若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚， 則黑質以 13d，紋狀體 18-21d 為宜；小腦以 20-21d 小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與 DRG 聯合培養，常用 4-7d 雞胚或 12-14d 小鼠胚胎，取材易，神經成活率高。  

（二）取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固 定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。 

（三）細胞分離與接種 細胞分離與接種。神經組織用 0.125-0.25%胰蛋白酶在 37℃孵育 30min， 移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充 分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于 培養皿（1×106） ，做電生理應為 5×105 或更低。 

（四）抑制膠質細胞生長 或 5-FU 抑制神經膠質細胞的生長。 抑制膠質細胞生長。培養 3-5d 后，也有人認為培養 7d 后，用阿糖胞苷。 

（五）觀察。接種 6-12h，開始貼壁，并有集合現象，細胞生長突起明顯，5-7d 膠質細胞增生明顯，7-10d 膠質細胞成片于神經細胞下面，形成地毯，2 周時神 經細胞生長最豐滿，四周暈光明顯，一個月后，有些神經細胞開始退化，變形， 甚至出現空泡，一般培養 2-4 周最宜。 但神經細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會有細胞周期，而 且隨培養時間的延長， 細胞數量在下降， 但膠質細胞可以， 神經膠質細胞也可以。 在培養過程中，早期 9-12d 時，有較多的神經細胞死亡，這是第一次死亡階段， 應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多，且相互形成 突觸。 常用培養細胞實驗有： 

（六）常用培養細胞實驗有：FCM 的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析； 免疫組化分析； 但免疫組化分析應注意，由于抗體直接作用于活細胞，不易穿透活細胞，故對核 內抗原定位時，首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性 或采用冰凍方法解決。 在免疫組化中，或其它組織學染色中，常用不同的染色方法以區分不同細胞，如 半乳糖腦苷脂對小樹突膠質細胞標記明顯；GFAP 對星形膠質細胞具有特異性染 色等。這對研究神經系統中膠質細胞功能具有極大的應用價值。神經膠質細胞以 往多被忽視，其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷） 、退行性疾病（如 AD、PD） 、損 傷后膠質細胞的填充等具有不可忽視的作用。 它也是神經細胞功能和營養支持的 物質基礎。

第四節 肌組織細胞培養

各種肌組織均可用于培養，以心肌和骨骼肌較實用。 

（一）骨骼肌細胞培養 

1、出生 1 一 2 天的乳鼠，引頸處死。 

2、無菌取大腿肌組織，切成 0.3 一 0.5cm2 小塊后，用不含鈣鎂離子的 Hanks 液配的 0.25%胰蛋白酶消化，無菌紗網或紗布濾過。 

3、計數調整細胞密度。 

4、快接種量 2×106/皿入培養基培養。 

5、培養基內含 10%小牛血清，可加 1%的胎汁以促進分化。 接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化，明膠配置：用 Hanks 液配成 0.01% 明膠。 該細胞接種率約 50%，細胞生長開始呈紡錘形，培養 50－52 小時后出現融合形 成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內能見到收縮現象。 

（二）心肌細胞培養 

心肌細胞是最早的培養材料，Carrel 曾長期培養過心肌組織，至今心肌仍不失 為好的培養物，最常用的是雞胚心肌。 心肌比較容易培養和生長，可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法，均可獲良 好的效果。取心室肌培養較好，原代培養的雞胚心肌呈紡錘形，培養成功時，一 周后可見節律性收縮現象。

第五節 巨噬細胞培養

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的 重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細 胞群，在條件適宜下可生活 2－3 周，多用做原代培養，難以長期生存。 巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難 以建株。 培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞， 以小鼠腹腔取材法最為實用， 其法如下： 1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯 lml（勿注入腸內！，以 ） 刺流產生大量的巨噬細胞。 2、引頸處死小鼠。 3、手提鼠尾將其全浸入 70%乙醇中 3－5 秒。 4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁， 把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。 5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同時用手指從 兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。 6、 用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側． 使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。 7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。 8、4℃下 250g 離心 10 分鐘后，去上清，加 10ml Eagle 培養基。 9、計數細胞。每只鼠可產生 20 一 30×106 細胞，其中 90%為巨噬細胞。 10、以 3×105 個貼附細胞/平方厘米接種。 11、接種數小時后，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用 Eagle 液沖洗 1 一 2 次，再加新 Eagle 培養液置 CO2 溫箱中。 

第六節 腎小球分離、移植培養

SD 大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡 1～2 分鐘，2 次，置超凈臺內，打開腹腔 取出腎臟剪碎，置含 Hank's 液的無菌培養皿洗滌，置 80 目不銹鋼篩網上。用扁 平自制小鏟輕輕碾磨產物微小組織透過篩網，濾過組織 Hank's 液混合物用吸管 吸至 120 目不銹鋼篩網，濾過，去小組織塊，濾過物吸至 200 目不銹鋼篩網，輕 輕濾過， Hank's 液洗滌 1 次， 收集網上腎小球， 鏡下觀察為分離良好的腎小球。 腎小球用 0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化 20 分鐘，加血清終止胰酶反應，離 心除去膠原酶。處理過的腎小球計數后接種至 24 孔培養板或 25ml 培養瓶，使腎 小球大于 60 個/cm2，加培養基 5～10ml（培養基組成：F12—3T3 上清 1：1；5% 馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素 5μg/ml；25ng/ml 氫化可的松；5μg/ml 轉鐵 蛋白；25ng/ml 前列腺素 E1；甲狀腺素 0.02ng/ml；D-纈氨酸 150ng/ml）腎小球培養 8～10 天，去除腎小球未生長組分，細胞繼續培養 24 小時，形態學觀察： 細胞生長成單層多角型細胞，直徑約 100μm。

第七節 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成 1mm3 小塊，用 0.5%膠原酶室溫消化 30 分鐘到 1 小時，再加等體積 0.2%胰酶消化 5～8 分鐘，在消化過程中用吸管吹打 組織塊或用自制裝置 （分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接 而成，濾器中間墊兩層絲質材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組 織以分離單細胞，終止酶消化方法同上。 常規方法接種培養收獲細胞。