微流控(microfluidics)技術(shù)是一種針對(duì)極小量 (10-9 ~10-18 L)的流體進(jìn)行操控的系統(tǒng)科學(xué)技術(shù). 微流控芯片(microfluidic chips)是微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)的主要平臺(tái)和技術(shù)裝置, 其主要特征是容納流體的有效結(jié) 構(gòu)(通道、反應(yīng)室和其他某些功能部件)至少在一個(gè)維 度上為微米級(jí)尺度. 在這一尺度下, 流體的運(yùn)動(dòng)具有 自己的特點(diǎn), 與宏觀尺度大不相同. 隨著半導(dǎo)體微加 工工藝技術(shù)在微流控芯片制備中的廣泛應(yīng)用, 以及 使用彈性材料多層構(gòu)建等新技術(shù)的發(fā)展, 人們已經(jīng) 可以將多種功能性的元件和結(jié)構(gòu)規(guī)模集成在一塊幾個(gè)平方厘米大小的芯片上. 我們將這種包含多種結(jié)構(gòu)或多個(gè)功能的、精確可控的復(fù)雜微流控芯片稱之為 “集成微流控芯片”。

化學(xué)及現(xiàn)代生物學(xué)的大部分實(shí)驗(yàn)都是在溶液狀 態(tài)下進(jìn)行的, 這些實(shí)驗(yàn)都需要盛裝液態(tài)物質(zhì)的容器, 例如燒杯、燒瓶、試管、培養(yǎng)皿等; 也大量涉及到液 體的轉(zhuǎn)移與輸運(yùn)器材, 例如移液管、滴管、量筒、各種管材等. 在這些實(shí)驗(yàn)中, 通常所運(yùn)用的體積單位是 毫升(常見(jiàn)于化學(xué)實(shí)驗(yàn))和微升(常見(jiàn)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)). 在與生命科學(xué)相關(guān)的研究中隨著通量的上升和樣品 量的限制, 我們所研究的體系開(kāi)始使用更小的體積 尺度, 這就需要我們用新的技術(shù)手段來(lái)進(jìn)行更小尺 度下的實(shí)驗(yàn)操作與觀測(cè). 微流控芯片就是在這樣的 一種需求下應(yīng)運(yùn)而生的技術(shù), 用以進(jìn)行微量甚至極微量液體的操縱與分析。

1975 年, 斯坦福大學(xué)的 Terry 等人在硅片上制作了第一個(gè)小型的氣相色譜分析儀, 這個(gè)儀器中的關(guān)鍵部件是一個(gè)在硅片上通過(guò)微加工手段蝕刻的微 細(xì)通道, 可以形象地看作是一根利用硅片制備的毛 細(xì)管類似物. 這個(gè)芯片可能是第一個(gè)現(xiàn)代意義上的 實(shí)用型“微流控”器件. 它的特點(diǎn)是體積小、分析所需時(shí)間短, 但是由于技術(shù)限制, 這種硅芯片并未引起廣 泛重視. 隨后, 微流控技術(shù)的發(fā)展相對(duì)緩慢, 直到 1990 年 Manz 等人提出“微全分析系統(tǒng)(micro total analysis system, mTAS)”的概念, 才進(jìn)入了迅速發(fā)展 的時(shí)期. 微全分析芯片的概念具有很強(qiáng)的吸引力, 它的主要特點(diǎn)是將待分析樣品的前處理、分離以及檢測(cè) 等步驟高度集成化, 在一塊芯片上完成. 隨后的近 20 年時(shí)間內(nèi), 在潛在應(yīng)用前景的鼓舞下, 微流控技 術(shù)的發(fā)展速度大大加快. 同時(shí), 以微電子加工和微機(jī) 電加工為背景的微加工技術(shù)不斷發(fā)展, 達(dá)到了一個(gè) 相對(duì)成熟的時(shí)期, 為微流控芯片的加工和推廣提供了技術(shù)平臺(tái), 并使得芯片制作的成本得以大大降低。

如今, 微流控分析芯片特別是具備高密度、大規(guī) 模、高通量、多功能等特點(diǎn)的集成微流控芯片已經(jīng)在 化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用. 與宏觀尺度 的實(shí)驗(yàn)裝置相比, 這一技術(shù)顯著降低了樣品的消耗 量, 增大了流體環(huán)境的表面積, 提高了反應(yīng)效率, 同 時(shí)也降低了實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生廢物對(duì)環(huán)境的污染; 集成微流 控芯片操作的并行性優(yōu)勢(shì)可以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的高通量、自 動(dòng)化控制; 并且通過(guò)微閥微泵等微細(xì)結(jié)構(gòu)的精確控 制, 微流控芯片在提高生命科學(xué)研究的時(shí)間與空間 分辨率上有很大的靈活性, 具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。

1.集成微流控芯片的制備

微流控芯片所使用的材料是多種多樣的, 早期的芯片制備中硅和玻璃成為最重要和最常見(jiàn)的材料. 這些材料的加工工藝比較成熟, 通過(guò)光刻等圖案化 手段可以使玻璃基片的特定圖案暴露而其余部分被 光刻膠或者金屬鍍層所保護(hù), 再利用氫氟酸或其緩 沖蝕刻劑(例如氫氟酸和氟化銨混合溶液)與暴露部 分的玻璃反應(yīng), 腐蝕出凹槽. 這些凹槽的上部同另一 平整表面封接后就形成了管道, 完成了微流控芯片的構(gòu)建. 這種利用玻璃腐蝕工藝制作微流控芯片的技術(shù)被廣泛用于芯片電泳的應(yīng)用中. 這類材料同時(shí)具有一定局限性, 因?yàn)樗鼈兺ǔ＞哂泻艽蟮膭傂? 在 玻璃或者硅片上要想實(shí)現(xiàn)微全集成所必需的微泵和微閥等單元的制作是非常困難的. 同時(shí)硅片在紫外 及可見(jiàn)光區(qū)不透明, 限制了其用于光學(xué)尤其是激光誘導(dǎo)熒光的檢測(cè). 玻璃材料制備的微流控芯片在電泳分離與分析上應(yīng)用方便, 但其在制備過(guò)程中對(duì)工藝的要求相對(duì)比較嚴(yán)格, 在大多數(shù)傳統(tǒng)的化學(xué)與生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不易推廣. 這一類材料制備的芯片在 集成度上往往受到限制, 難以取得方法學(xué)上的突破. 要實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量、多功能的集成, 需要發(fā)展更 合適的加工方法與新的制備材料. 1998 年, 美國(guó)哈佛大學(xué) Whitesides 研究組提出了軟蝕刻(soft lithography) 的概念, 并且演示了應(yīng)用模型復(fù)制的快速成型法制作微流控芯片的技術(shù), 這一技術(shù)在幾年內(nèi)得以拓展, 成為一種新型的微加工手段, 從此宣告微流控芯片進(jìn)入了以聚二甲基硅氧烷(poly(dimethyl siloxane), PDMS)為關(guān)鍵材料的時(shí)代. 利用 PDMS 材料制備微 器件的一個(gè)主要特點(diǎn)是加工方便, 不需要特別苛刻 的實(shí)驗(yàn)條件和昂貴的加工設(shè)備, 這一優(yōu)點(diǎn)促使微流控芯片又進(jìn)入了新一階段的快速發(fā)展時(shí)期. Effenhauser 等人最先用 PDMS材料做成微流控芯片用于 DNA 分析, 整個(gè)芯片利用電滲流來(lái)控制. 芯片的制備不再神秘, 普通的實(shí)驗(yàn)人員也可以輕松完成。

軟蝕刻方法的基本制備過(guò)程如圖 1 所示. 首先利用計(jì)算機(jī)輔助, 通過(guò)合適的程序進(jìn)行管道設(shè)計(jì); 之后制備光刻掩膜, 由于許多芯片中流體管道的寬度處在幾十至幾百微米的量級(jí), 甚至可以使用高分辨 率的打印機(jī)將管道設(shè)計(jì)圖打印在透明膠片上替代價(jià) 格昂貴的傳統(tǒng)鉻版掩膜; 再將光刻掩膜利用光刻技術(shù)將掩膜圖案轉(zhuǎn)移到涂有光刻膠的硅片上. 以SU-8負(fù)性光刻膠為例, 需要聚合的區(qū)域通過(guò)掩膜的透明 部分接受紫外照射后發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而聚合, 未經(jīng)過(guò)紫外照射的區(qū)域則可以被顯影液溶解, 之后硅片及其表面上剩下的突起的SU-8 結(jié)構(gòu)構(gòu)成制作 PDMS 微 流控芯片的陽(yáng)模. 做好模板后, 首先將模板硅片用含 惰性基團(tuán)(如氟代烷基)的硅烷處理以防止下一步操作時(shí)PDMS和硅片的永久鍵合. 然后將 PDMS 預(yù)塑 體(由兩種不同化學(xué)官能化的硅氧烷組成, 按照一定比例混合)澆鑄到模板硅片上, 之后將其處于 40℃ ~80℃加速 PDMS 預(yù)塑體固化, 再將固化后的 PDMS 從模板上揭下來(lái), 用打孔針在合適的位置上打孔作 為溶液的進(jìn)出口, 最后將 PDMS 基片帶有管道的一 面與其他平面結(jié)合, 進(jìn)行可逆或不可逆性的密封完成芯片制作.

圖 1 基于軟蝕刻技術(shù)的芯片快速?gòu)?fù)制法

軟蝕刻技術(shù)的出現(xiàn), 為制備集成微流控芯片, 尤其是與集成電路相類似的多功能、高密度集成微流控芯片, 開(kāi)辟了一條新的道路. 2000 年, 美國(guó)加州理工學(xué)院的 Quake 研究組發(fā)明了多層軟蝕刻技術(shù) (multilayer soft lithography), 巧妙地利用了 PDMS 材 料的彈性性質(zhì)和聚合特性, 在芯片上整合了可以快 速、準(zhǔn)確控制流體流動(dòng)的微型氣動(dòng)閥, 實(shí)現(xiàn)了在芯片 上高密度流體運(yùn)動(dòng)的控制, 為高通量大規(guī)模的功能 集成提供了可能性. 兩年以后, 他們以“微流控大規(guī) 模集成芯片”為題報(bào)道了集成有上千個(gè)閥門和上百個(gè) 微反應(yīng)室的PDMS芯片, 實(shí)現(xiàn)了微流控芯片由簡(jiǎn)單 的單元操作到規(guī)模集成芯片的飛躍. 多層軟蝕刻 技術(shù)是傳統(tǒng)軟蝕刻技術(shù)的重要拓展, 它通過(guò)創(chuàng)造三維交疊管道以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單有效的流體運(yùn)動(dòng)控制, 主動(dòng) 閥的功能即是通過(guò)在芯片中相互交叉的立體管道來(lái) 實(shí)現(xiàn). 當(dāng)對(duì)下層(控制層)施加正氣壓時(shí), 處于兩層之 間的薄膜會(huì)產(chǎn)生向上的變形, 如果氣壓足夠, 可以很 好地封閉住上層(流體層)(圖 2). 該種主動(dòng)閥的反應(yīng) 時(shí)間為毫秒量級(jí), 壓力在 100 kPa 量級(jí). 用同樣的方 法, 他們?cè)谝粭l簡(jiǎn)單的流體管道上平行排列了三個(gè) 控制閥, 構(gòu)成一種蠕動(dòng)泵. 這種通過(guò)多層軟蝕刻技術(shù) 制備的主動(dòng)閥有體積小、密封性好、透光性好、響應(yīng) 快、可精確驅(qū)動(dòng)、高度集成化、使用時(shí)間長(zhǎng)、制作簡(jiǎn) 單、成本低等優(yōu)勢(shì), 被廣泛使用到高通量的集成微流 控芯片中. 這一技術(shù)在集成微流控芯片短短的發(fā)展 歷程中具有里程碑意義, 極大地推動(dòng)了微流控技術(shù) 在化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用, 并解決了許多傳統(tǒng)技術(shù)或者單一功能芯片無(wú)法解決的難題.

圖2 利用多層軟蝕刻制備微流控壓力可控閥門的示意圖

1.集成微流控芯片的應(yīng)用

2.1 集成微流控芯片在細(xì)胞培養(yǎng)與控制中的應(yīng)用

細(xì)胞是生命的基本組成單元, 細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)之一. 我們已有的許多認(rèn)識(shí)是建 立在針對(duì)大量細(xì)胞的系綜平均結(jié)果基礎(chǔ)上的, 但是 近年來(lái)的深入研究使許多生命現(xiàn)象的發(fā)生過(guò)程已經(jīng) 無(wú)法從系綜平均上得以闡明, 在少量細(xì)胞乃至單個(gè) 細(xì)胞層次上進(jìn)行生命科學(xué)的研究呈現(xiàn)出了迫切的重 要性. 絕大多數(shù)細(xì)胞的大小位于微米尺度, 正好同微 流控芯片中的通道大小相適應(yīng), 這一匹配為少數(shù)或 者單個(gè)細(xì)胞的操控提供了極為便捷的條件. 集成微 流控芯片在操作上很強(qiáng)的可控性同時(shí)為進(jìn)行原位的 細(xì)胞培養(yǎng)以及動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)的微環(huán)境調(diào)控提供了可能性, 在小體積內(nèi)進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)還可以同時(shí)保持合適的濃度、較短的傳質(zhì)時(shí)間、較快的時(shí)間響應(yīng)和長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)追蹤等.

集成微流控芯片在發(fā)揮高通量?jī)?yōu)勢(shì)同時(shí), 可以鎖定單個(gè)細(xì)胞, 成功地進(jìn)行細(xì)胞受激反應(yīng)和調(diào)控的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀察與研究, 同時(shí)可以觀察細(xì)胞間通訊 對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)機(jī)制, 得以了解生物體反饋機(jī) 制的真正奧秘, 而不是由于系綜統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)造成的假 象. 如果能夠定量的進(jìn)行單細(xì)胞分析, 將會(huì)對(duì)生命過(guò) 程的細(xì)節(jié)有更深刻的認(rèn)識(shí). 斯坦福大學(xué)的 Zare 研究 組[11]利用液體在微流控通道內(nèi)層流的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了對(duì) 單個(gè) Jurkat T 細(xì)胞的俘獲、破膜、染色、特定分子檢 測(cè)等多個(gè)分析步驟, 得到了在刺激下不同單細(xì)胞的 響應(yīng), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 基于單細(xì)胞的分析手段可以揭 示許多在多細(xì)胞分析中被掩蓋的個(gè)體區(qū)別, 對(duì)于理 解細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)有重要作用. 當(dāng)然這種依靠層流方 式來(lái)獲取一個(gè)一個(gè)單細(xì)胞的方法很難發(fā)展成為高通 量的技術(shù), 而且工作條件對(duì)穩(wěn)定性有很大影響, 通量 也很難得以擴(kuò)大.

為了實(shí)現(xiàn)高通量的實(shí)驗(yàn), 加州大學(xué)伯克利分校 的 Lee 研究組提出了一種在微流控芯片中加工大規(guī) 模的微攔截陣列以批量攔截單細(xì)胞的方法. 利用 PDMS芯片的雙層結(jié)構(gòu), 在攔壩的下方與基底之間有2μm的縫隙, 允許液流通過(guò)但細(xì)胞卻無(wú)法通過(guò)而被 攔截, 這一簡(jiǎn)單的流體動(dòng)力學(xué)方法即可以將細(xì)胞有 效地俘獲, 通過(guò)改變攔壩的形狀還可以控制每個(gè)攔壩可以攔截的細(xì)胞數(shù)量. 作者利用熒光分子探針?lè)?析了單個(gè)細(xì)胞中羧基酯酶的活性, 展示了這種系統(tǒng) 可以高效率地實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的分析研究, 是一種高密 度顯微成像的單細(xì)胞定量分析方法. 格拉斯哥大學(xué) 的 Cooper 研究組借鑒這種單細(xì)胞攔截陣列的方法, 對(duì)單腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研 究. 細(xì)胞在芯片的攔壩上受到的剪切力較小, 結(jié)果表 明這種高內(nèi)涵(high content)顯微分析的方法對(duì)細(xì)胞 凋亡的有效評(píng)估可以與流式細(xì)胞儀相比擬, 而且需 要的試劑量大大降低, 操作也更為簡(jiǎn)便[13]. 在傳統(tǒng) 的藥物篩選過(guò)程中常常需要大量的細(xì)胞培養(yǎng)、多條件 的篩選和專業(yè)化的人員配備, 而集成微流控芯片高 通量、并行化、自動(dòng)化的特點(diǎn)非常適合于藥物篩選的研究. 麻省理工學(xué)院的 Thorsen 研究組報(bào)道了 一種并行裝載并培養(yǎng)細(xì)胞的陣列芯片裝置, 用于藥 物毒性的篩選. 細(xì)胞裝載管道與毒素刺激物的管道 相垂直, 在兩種管道的交匯處有圓形的細(xì)胞捕獲小室, 每個(gè)小室中包含 8 個(gè) U 型的細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu), 經(jīng)過(guò) 流體力學(xué)計(jì)算和設(shè)計(jì)使得這些結(jié)構(gòu)可以均一地捕獲 一定數(shù)目的細(xì)胞, 同時(shí)保證每個(gè)小室內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的 相對(duì)均勻. 通過(guò)合理控制芯片上的氣動(dòng)閥門, 可以對(duì) 許多平行的細(xì)胞裝載管道與毒素管道進(jìn)行單獨(dú)控制 操作. 他們?cè)谕粡埿酒现谱髁?576 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)小 室, 可以同時(shí)獲得 3 種細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞, 宮頸 癌細(xì)胞, 牛內(nèi)皮細(xì)胞)分別對(duì) 5 種不同毒素刺激物(洋 地黃皂苷、皂草苷、CoCl2、NiCl2、丙烯醛)的組合反 應(yīng). 該方法將細(xì)胞的裝載固定、連續(xù)培養(yǎng)、藥物處理 和結(jié)果分析等實(shí)驗(yàn)過(guò)程全部集成在一塊芯片上.

形成雜交細(xì)胞瘤和體細(xì)胞重組是生物學(xué)研究的 重要內(nèi)容, 而控制細(xì)胞的融合是這些研究的基礎(chǔ), 也 是實(shí)驗(yàn)中面臨的技術(shù)挑戰(zhàn). 由于傳統(tǒng)的方法很難解 決細(xì)胞高效配對(duì)與融合的問(wèn)題, 細(xì)胞在大規(guī)模上的 隨機(jī)配對(duì)導(dǎo)致融合的效率不高. 美國(guó)麻省理工學(xué)院 的 Voldman 研究組采用集成微流控芯片技術(shù), 加工出雙層的大規(guī)模微陣列用來(lái)攔截細(xì)胞. 與簡(jiǎn)單的 細(xì)胞攔截芯片不同, 他們?yōu)榱俗尣煌?xì)胞達(dá)到“A-B” 形式的配對(duì), 在每個(gè)微攔壩的背部加工了一個(gè)只可 容納一個(gè)細(xì)胞的缺口, 而在正面則加工了一個(gè)可以 容納兩個(gè)細(xì)胞的缺口. 實(shí)驗(yàn)中首先從反方向灌注 A 細(xì)胞懸液, A 細(xì)胞被攔壩背面的缺口攔截, 每個(gè)攔壩 只攔截一個(gè) A 細(xì)胞. 然后溶液從正方向灌入, 使原先 攔截在攔壩背面的 A 細(xì)胞脫離落入下游攔壩的正面缺口中. 由于層流的作用, 很少會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞占據(jù) 一個(gè)正面缺口的情況. 最后 B 細(xì)胞從正向灌入芯片, 進(jìn)入正面缺口內(nèi)剩下的一個(gè)細(xì)胞空間內(nèi), 這樣微攔 壩上攔截了的兩個(gè)細(xì)胞就基本上成了“A-B”組合(圖 3(a)). 兩個(gè)單細(xì)胞的融合既可以用聚乙二醇(PEG)輔助, 也可以通過(guò)在芯片內(nèi)上下兩方集成的電極施加 脈沖電位來(lái)實(shí)現(xiàn)電穿孔融膜. 與傳統(tǒng)方法相比, 微流 控芯片將 PEG 融合的效率從 6%提高到了 25%左右, 將電融合效率從 11%提高到 50%以上, 總體而言, 該方法將細(xì)胞融合的效率提高了 3~10 倍, 是對(duì)傳統(tǒng) 方法難以控制和實(shí)現(xiàn)的問(wèn)題利用集成微流控芯片得 以解決的一個(gè)范例.

在與細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作中, 高通量和長(zhǎng)時(shí)間 的培養(yǎng)常常是必須的步驟. 在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí) 的微環(huán)境調(diào)控、形態(tài)觀察、生化檢測(cè)等操作往往會(huì)帶 來(lái)污染的風(fēng)險(xiǎn), 對(duì)保證實(shí)驗(yàn)的平行性和重現(xiàn)性也帶 來(lái)挑戰(zhàn). Quake 研究組在他們發(fā)展的大規(guī)模集成微 流控芯片的基礎(chǔ)上提出了一種全過(guò)程自動(dòng)化的高通 量活細(xì)胞培養(yǎng)微流控系統(tǒng)[18]. 該系統(tǒng)集成了 96 個(gè)可 獨(dú)立尋址的微培養(yǎng)腔, 每個(gè)微腔的工作體積只有 60 nL, 這種獨(dú)立的高通量培養(yǎng)微腔和可控性適合各 種自行設(shè)計(jì)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和篩選研究(圖 3(b)). 作 者在該芯片上培養(yǎng)人間葉干細(xì)胞(Human primary mesenchymal stem cells), 研究了短期刺激對(duì)細(xì)胞增 殖和細(xì)胞中堿性磷酸酶活性的影響. 細(xì)胞可以在芯 片上連續(xù)培養(yǎng) 240 h 以上, 結(jié)合自動(dòng)控制的熒光顯微 鏡可以在無(wú)人值守情況下完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程. 這一 成果充分展示了大規(guī)模集成的微流控芯片作為一種 新的細(xì)胞培養(yǎng)和研究工具的高效性和普適性.

除了通過(guò)高通量的實(shí)驗(yàn)獲得大量數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)分析外, 進(jìn)行高時(shí)空分辨的細(xì)胞受激響應(yīng)研究是認(rèn) 知細(xì)胞內(nèi)部生化反應(yīng)過(guò)程的必要手段. 集成微流控 芯片在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分析的時(shí)間與空間分辨上有很大的 靈活性, 具有不可替代的優(yōu)勢(shì). 通過(guò)芯片的精確控制, 目的細(xì)胞可以被分配到芯片上指定的位置, 通過(guò)定 時(shí)、定點(diǎn)的刺激來(lái)實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞刺激并可以實(shí)現(xiàn) 原位實(shí)時(shí)觀測(cè) . 加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)的 Hansen 研究組[19]近期一篇報(bào)道利用多層軟蝕刻技術(shù) 制備的芯片采用半壓閥門控制捕獲懸浮的酵母細(xì)胞, 在一塊芯片上集成了 2048 個(gè)半壓微閥, 以實(shí)現(xiàn) 8 個(gè) 細(xì)胞系、每個(gè)細(xì)胞系同時(shí)進(jìn)行 32 種定時(shí)刺激、每種 刺激有 8 個(gè)并行實(shí)驗(yàn)的全目標(biāo). 整個(gè)實(shí)驗(yàn)通過(guò)自動(dòng)的實(shí)時(shí)控制和顯微圖像拍攝來(lái)獲取大量數(shù)據(jù). 這一實(shí)驗(yàn)展示了高集成度的微流控芯片作為一種新的細(xì)胞生物學(xué)研究工具, 在系統(tǒng)生物學(xué)研究領(lǐng)域具有巨大潛力.

圖3 集成微流控芯片對(duì)細(xì)胞的操控與全自動(dòng)培養(yǎng) (a) 利用芯片的加工對(duì) A 和 B 細(xì)胞配對(duì)精確控制, 并在芯片上進(jìn)行高效率細(xì)胞融合[17]; (b) 全集成微流控芯片對(duì)細(xì)胞的全自動(dòng)化連續(xù)培養(yǎng)

集成微流控芯片在細(xì)胞培養(yǎng)特別是細(xì)胞微環(huán)境 控制和單細(xì)胞培養(yǎng)上的優(yōu)勢(shì)是明顯的, 芯片體系可 以自動(dòng)化地進(jìn)行許多細(xì)胞培養(yǎng)、分離、富集以及分析 步驟, 大大減少了人為誤差、人力資源和試劑消耗. 即使與成熟的孔板技術(shù)相比, 集成微流控芯片所消 耗的試劑更少、實(shí)驗(yàn)通量更高, 還可以擺脫孔板實(shí)驗(yàn)中邊緣效應(yīng)的干擾, 具有很好的潛力. 當(dāng)然, 集成微流控芯片在細(xì)胞培養(yǎng)和操控上也存在一些局限性和挑戰(zhàn). 首先, 芯片可以做得集成度很高, 但是外部的 控制設(shè)備過(guò)于復(fù)雜, 如何簡(jiǎn)化芯片的操作, 使之更適 應(yīng)于化學(xué)家和生物學(xué)家的工作習(xí)慣, 是需要不斷加 以改進(jìn)的技術(shù)問(wèn)題; 其次, 芯片中細(xì)胞以及其他試劑 的注入與回收存在許多芯片外的消耗, 這些消耗存 在于連接管道、移液附件、外置泵體等處, 往往超過(guò) 了芯片上的消耗, 如何解決這個(gè)“世界到芯片”的界 面問(wèn)題, 也需要不懈的努力; 第三, 在芯片內(nèi), 由于微環(huán)境可以精確控制, 且由于體積很小, 傳質(zhì)轉(zhuǎn)熱等 過(guò)程都比較迅速, 這些環(huán)境如何在其他體系中再現(xiàn), 使許多過(guò)程可以移植到更大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)中, 也常常 成為一個(gè)難題.

2.2 集成微流控芯片在核酸與蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

核酸與蛋白質(zhì)是兩類最為重要的生物大分子, 對(duì)核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控過(guò)程的認(rèn)識(shí)與研 究為人類在分子水平上研究生命的本質(zhì)奠定了基礎(chǔ). 微流控芯片技術(shù)是研究核酸和蛋白質(zhì)的良好平臺(tái): (1) 芯片上的液體消耗量極小, 可以對(duì)極微量液體方便 地進(jìn)行操控, 對(duì)于核酸和蛋白質(zhì)這些生物大分子而 言,可以減少樣品量、增加濃度, 并且有利于實(shí)現(xiàn)核酸 和蛋白質(zhì)的快速并行化分析; (2) 芯片的尺度在微米 范圍, 該尺度下不僅僅傳質(zhì)和擴(kuò)散速度很快有利于 分析過(guò)程的許多操作快速完成, 而且小尺度還具有 常規(guī)尺度下不具備的某些性質(zhì)如層流, 電滲等可以 很好地應(yīng)用到分離分析中; (3) 集成化的多功能芯片 實(shí)現(xiàn)了在極小尺寸下多個(gè)實(shí)驗(yàn)操作步驟的整合 和流程化操作, 在核酸和蛋白質(zhì)的分析中, 可以從細(xì) 胞的培養(yǎng)開(kāi)始, 通過(guò)消化、裂解、提取、富集、純化、 標(biāo)記、分離、信號(hào)放大、結(jié)果讀出等多個(gè)操作環(huán)節(jié), 完 成全部的操作得到最終數(shù)據(jù), 有助于減少樣品損失 和避免污染與實(shí)驗(yàn)操作人為誤差.

加州大學(xué)伯克利分校的 Mathies研究組報(bào)道了 一種用于超高通量基因分析的微流控裝置. 整個(gè)裝 置設(shè)計(jì)在一個(gè)直徑為 200 mm 的圓盤狀玻璃片上, 由 384 條以輻射狀排列的毛細(xì)微流管道組成. 分析時(shí), 可以將樣品加入到芯片邊緣的儲(chǔ)液池中, 之后樣品 通過(guò) 8 cm 長(zhǎng)的微流管道進(jìn)行分離, 最后用自制的四 色旋轉(zhuǎn)共聚焦熒光掃描儀進(jìn)行檢測(cè). 利用該裝置, 在 325 s 的時(shí)間內(nèi)完成了 384 個(gè)在人的 HPE 基因中與血 色沉著病相關(guān)聯(lián)的 H63D 突變體的分析. 這種 384 道 微毛細(xì)管陣列分析電泳(μCAE)制作簡(jiǎn)單, 可工業(yè)化 生產(chǎn), 將會(huì)大大提高篩選的速度, 有望成為一種有力 的分析工具. 該研究組最近報(bào)道了利用電泳技術(shù)在 芯片上對(duì)基因沉默細(xì)胞群中的單細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá) 量的全集成分析. 該研究組最近報(bào)道了利用電泳在 芯片上實(shí)現(xiàn)了基因沉默處理的細(xì)胞中的單細(xì)胞的基 因表達(dá)量的全集成分析. 該方法將單細(xì)胞捕獲、細(xì)胞裂解、cDNA 合成、親和富集、電泳檢測(cè)全部功能 集成在了一塊芯片上, 整個(gè)分析過(guò)程只需要 70 min 左右(圖 4). 集成在微腔中的微金“島嶼”通過(guò)寡核苷 酸的修飾和表面修飾有互補(bǔ)鏈的細(xì)胞相互作用, 由 于“島嶼”的面積(25 μmm二次方 )僅夠容納一個(gè)細(xì)胞, 所以每次分析嚴(yán)格地只分析一個(gè)單細(xì)胞. 細(xì)胞被捕獲后通 過(guò)裂解和逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 片段, 在經(jīng)過(guò) 30 次循環(huán) 的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR) 擴(kuò)增后基因信號(hào)被顯著地放大, 集成在芯片管道上 的一段親和凝膠柱將待測(cè)基因片段進(jìn)行有效的富集 之后通過(guò)電泳的分離檢測(cè)得到目標(biāo)基因與對(duì)照基因 的相對(duì)表達(dá)量. 最終得到的基因沉默效率的結(jié)果與 常規(guī)大量細(xì)胞的分析結(jié)果有明顯不同, 在對(duì)單細(xì)胞 進(jìn)行分析的結(jié)果顯示按沉默效率來(lái)分類細(xì)胞可以被 分為兩個(gè)大致的亞群, 基因沉默的效率分別為 100% 和 50%, 而這種細(xì)節(jié)信息在常規(guī)大體相群體細(xì)胞的 分析中被完全“遮蓋”了. 集成微流控芯片的作用的 優(yōu)勢(shì)不僅在于實(shí)現(xiàn)了高通量的并行操作和把多步實(shí) 驗(yàn)步驟自動(dòng)化處理, 更重要的是, 它提供了可靠、高效 的新實(shí)驗(yàn)方法, 而這樣的實(shí)驗(yàn), 利用傳統(tǒng)的分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)器材很難獲得可靠的結(jié)果.

染色質(zhì)免疫沉淀的方法是經(jīng)典的研究 DNA 與蛋 白相互作用的方法,可以精確地定位與蛋白結(jié)合的基 因位點(diǎn). 傳統(tǒng)方法依賴于有經(jīng)驗(yàn)和技巧的實(shí)驗(yàn)人員, 需要細(xì)胞量大(105 ~107 ), 單次實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)(2~7 天). Quake 研究組[22]將這一方法在高度集成的微流控芯 片裝置上得以實(shí)現(xiàn), 芯片中環(huán)形管道上的閥門既可 以獨(dú)立使用, 也可以配合使用形成蠕動(dòng)泵. 對(duì)其精確 控制確保了每一步反應(yīng)不被過(guò)量地稀釋以及反應(yīng)的 充分與完全 (圖 5). 最終通過(guò)在芯片上的填充柱將 目標(biāo) DNA 片段捕獲和富集, 在芯片外完成定量 PCR 測(cè)定. 該方法克服了體相系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中的許多局限性, 實(shí)驗(yàn)僅需要 2000 個(gè)細(xì)胞就可以完成, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的 孵育時(shí)間由過(guò)夜縮短至 2 h, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)完成縮短至一 天之內(nèi), 并且自動(dòng)化的芯片控制系統(tǒng)可以無(wú)需有經(jīng) 驗(yàn)的技術(shù)人員控制免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中的細(xì)節(jié), 確保實(shí)驗(yàn)的成功和平行性.

2006 年, Quake 小組利用集成微流控技術(shù)發(fā)展了針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的 mRNA 富集和擴(kuò)增芯片, 進(jìn)行高 靈敏度的基因表達(dá)研究. 在常規(guī)方法中, 由于 mRNA 降解、非特異性吸附等問(wèn)題的存在, 在mRNA 純化、 cDNA 合成過(guò)程中不可避免存在樣品殘留或損失問(wèn)題, 因此要獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須依賴于大量細(xì) 胞的分析. 而利用集成微流控芯片高通量和多功能 化的特點(diǎn), 將單細(xì)胞捕獲、裂解、mRNA 純化、cDNA 合成以及 cDNA 純化五步反應(yīng)整合在一塊芯片上,有效降低了樣品損失, 快速、高效地實(shí)現(xiàn)了對(duì)單細(xì)胞 中低拷貝數(shù) mRNA 的分析研究. 同年, 哈佛大學(xué) 謝曉亮教授研究組利用β-半乳糖苷酶基因作為報(bào)告基因結(jié)合單分子熒光技術(shù)和微流控技術(shù)將單個(gè)的酵 母細(xì)胞封閉在微流控芯片的微培養(yǎng)腔室中, 研究了 單個(gè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)的隨機(jī)性. 芯片為單個(gè)酵母細(xì) 胞提供了相對(duì)封閉的微環(huán)境, 使得β-半乳糖苷酶催 化生成的熒光產(chǎn)物即使很快地被泵出到細(xì)胞外也可 以在微腔室中積累到足以被檢測(cè)到的濃度. 最近, 謝曉亮研究組利用集成微流控芯片結(jié)合單分子熒光 顯微技術(shù), 對(duì)培養(yǎng)于微管道中的大腸桿菌基因文庫(kù)進(jìn) 行單分子 mRNA 和相應(yīng)蛋白表達(dá)量的熒光標(biāo)記和高通 量成像分析. 結(jié)果表明, 在任意給定的基因文庫(kù)中, 單個(gè)細(xì)胞內(nèi) mRNA 的表達(dá)水平與對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有呈現(xiàn)相關(guān)性. 這種關(guān)聯(lián)性缺失的原因在于mRNA 與蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的壽命大不相同, 所以在 任意時(shí)刻, 單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白組和轉(zhuǎn)錄組是有顯著 區(qū)別的. 該研究為在單細(xì)胞單分子水平揭示蛋白組調(diào) 控和轉(zhuǎn)錄組調(diào)控的研究提供了新的平臺(tái)和思路(圖 6). PCR 方法是核酸研究的利器, 它能夠復(fù)制特定 的核酸序列, 使其不斷擴(kuò)增. 這一方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用 于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域, 為其帶來(lái)革命性的變化. 但 常規(guī) PCR 存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、試劑消耗量大等 缺點(diǎn). 集成微流控芯片以其在微小體積下顯著改善 熱能傳輸、極大提高熱循環(huán)速度、降低昂貴試劑的消 耗等優(yōu)勢(shì), 為 PCR 操作的進(jìn)一步優(yōu)化提供了一條可 行的途徑 . 充分利用微流控芯片高通量的優(yōu)勢(shì), Mathies 研究組報(bào)道了功能高度集成化的芯片(圖 7(a),(b)), 在該芯片上可以完成對(duì) RNA 的分析, 即可以將逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR), 擴(kuò)增產(chǎn) 物的電泳分離和熒光檢測(cè)在同一張芯片上完成. 這 種芯片不僅高度集成化, 而且極大縮短分析時(shí)間(整 個(gè)過(guò)程可以在 45 min 內(nèi)完成)、減少樣品消耗、避免 交互污染、提高檢測(cè)的靈敏度(RNA 分子的檢出下限 可達(dá)到 11 個(gè)拷貝), 從而可用于單細(xì)胞的基因表達(dá)分 析. 他們用該裝置檢測(cè)出了正常的乳腺組織和癌變的乳腺組織中 RNA 表達(dá)的不同.

圖 4 集成微流控芯片對(duì)單細(xì)胞中基因表達(dá)量的全集成分析過(guò)程示意圖[21] A~C: 單細(xì)胞被捕獲在微金“島嶼”上; D, E: 細(xì)胞被裂解, mRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA, PCR 擴(kuò)增; F: 一段親和柱有效富集目標(biāo)基因片段; G: 目標(biāo) 基因片段電泳分離與檢測(cè). 全過(guò)程在 80 min 之內(nèi)完成

圖 5 集成微流控芯片對(duì) 2000 個(gè)左右細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀的研究[22] (a) 芯片設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖, 4 個(gè)環(huán)形管路設(shè)計(jì)可以在一次實(shí)驗(yàn)中對(duì) 4 組樣品平行測(cè)定; (b) 染色質(zhì)免疫沉淀的基本過(guò)程示意圖

圖6 集成微流控芯片用于分析單個(gè)細(xì)胞中的單分子水平的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)[25] (a) 熒光標(biāo)記的寡聚脫氧核糖標(biāo)記單個(gè) mRNA 分子, 黃色熒光蛋白融合的基因標(biāo)記表達(dá)后的蛋白分子; (b) 芯片俯視圖和實(shí)驗(yàn)裝置示意圖; (c) YFP 在細(xì)胞中的表達(dá), 顯示出被轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因; 與該基因?qū)?yīng)的 mRNA 被轉(zhuǎn)錄; (d) 在某時(shí)刻時(shí)的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和對(duì)應(yīng)基因的蛋白 質(zhì)被翻譯水平關(guān)系圖, 表明在該時(shí)刻轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性

微流控技術(shù)還可以用于 DNA 的富集和擴(kuò)增. 在 微流控芯片內(nèi)進(jìn)行基因擴(kuò)增, 特別是針對(duì)單個(gè)細(xì)胞 的基因型分析和測(cè)序樣品準(zhǔn)備上, 和傳統(tǒng)方法相比, 具有單個(gè)實(shí)驗(yàn)用量小(納升甚至皮升)、利于高通量集 成、便于控制平行實(shí)驗(yàn)條件等優(yōu)點(diǎn). Quake 小組開(kāi)發(fā)的數(shù)位化 PCR 芯片(圖 7(c),(d))集成了大量納升微 反應(yīng)室, 當(dāng)含有目的基因序列的樣品被適當(dāng)稀釋后, 目的基因拷貝數(shù)在反應(yīng)室中的分布符合泊松分布規(guī) 律. 經(jīng)過(guò) PCR 過(guò)程, 最后觀察反應(yīng)室中產(chǎn)物的有無(wú), 即可通過(guò)計(jì)數(shù)反推得到目的基因的拷貝數(shù). 他們通 過(guò)從環(huán)境土壤中分離無(wú)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物 種群, 擴(kuò)增并分析了參與白蟻及其共生體系中的關(guān) 鍵酶的編碼基因, 發(fā)現(xiàn)了未知的以核糖體 RNA 為基 礎(chǔ)的共生生物物種[28]. 這一方法還被成功運(yùn)用于產(chǎn) 前診斷中, 通過(guò)對(duì)母親外周血內(nèi)來(lái)自胎兒的游離 DNA 的測(cè)量進(jìn)行產(chǎn)前染色體畸變疾病的篩查[29,30]. 這樣的裝置, 在對(duì)單細(xì)胞檢測(cè)有重要需求的干細(xì)胞 研究和測(cè)序研究可以大大提高效率、減少實(shí)驗(yàn)的成本 并減小實(shí)驗(yàn)誤差, 利用大規(guī)模集成的數(shù)位化PCR微流控芯片來(lái)進(jìn)行基因組測(cè)序樣本的質(zhì)量控制, 已經(jīng)取得了很好的效果, 為測(cè)序?qū)嶒?yàn)的成功提供了保證.

圖 7 集成微流控芯片用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)應(yīng)用實(shí)例 (a) 多通道 RT-PCR-CE 芯片結(jié)構(gòu)示意圖, 在 1 塊 100 mm 直徑的芯片上集成有阻抗加熱元件、加熱電極引出條、Ti/Pt 感應(yīng)溫度傳感器、PCR 反應(yīng)腔室、電泳分離通道和 PDMS 氣動(dòng)微閥; (b) 反應(yīng)腔室區(qū)域放大圖[26]; (c) 數(shù)位式集成化 PCR 微流控芯片示意圖, 深色, 反應(yīng)微腔室; 淺色, 微閥; (d) 數(shù)位式集成 PCR 反應(yīng)結(jié)果圖

傳統(tǒng)的核酸微陣列芯片依賴于高通量的自動(dòng)點(diǎn)樣系統(tǒng), 溶液的體積通常在微升級(jí)別; 有些其他方法, 如超聲聚焦和壓電噴液等, 可以實(shí)現(xiàn)皮升級(jí)別的液 體自動(dòng)分配和點(diǎn)樣, 但是通量較低且商品化儀器價(jià)格昂貴. 我們開(kāi)發(fā)了一種全新的高通量開(kāi)放式納升 級(jí)液體點(diǎn)樣芯片(圖 8). 該芯片通過(guò)氣壓推動(dòng)液體 在微管道中流動(dòng), 液滴進(jìn)而由開(kāi)放式出口擠出, 通過(guò) 編程控制各個(gè)液滴可尋址性的進(jìn)入玻璃芯片上對(duì)應(yīng) 位置的微孔. 定量 PCR 結(jié)果證實(shí)了該芯片的高度并 行性、重復(fù)性和可控性. 便捷的操作和開(kāi)放式接口的 設(shè)計(jì), 使該芯片在高通量核酸定量分析、高通量藥物篩選等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.

圖 8 微流控微分配裝置示意圖 微分配芯片在精密步進(jìn)電機(jī)的帶動(dòng)下配合下方微池芯片實(shí)現(xiàn)高通量 的自動(dòng)化溶液分配

在免疫分析中最為人們所熟悉的檢測(cè)手段之一 就是 ELISA(酶聯(lián)免疫檢測(cè)), 傳統(tǒng)方法在操作過(guò)程中 需要受過(guò)專門訓(xùn)練的技術(shù)人員進(jìn)行操作而且費(fèi)時(shí)費(fèi) 力, 為一些重要疾病的診斷與治療監(jiān)測(cè)帶來(lái)麻煩. 利 用集成微流控芯片的優(yōu)勢(shì)有望實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化且方便的 ELISA 檢測(cè). 在相對(duì)復(fù)雜的集成微流控芯片操作中, 控制流體的運(yùn)動(dòng)是關(guān)鍵, 巧妙地驅(qū)動(dòng)液體運(yùn)動(dòng)可以 大大簡(jiǎn)化芯片的使用難度. Lai等人[32]報(bào)道了一種 CD 光盤式的用來(lái)進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析(ELISA)的微流控操 作平臺(tái). 整個(gè)微流控操作平臺(tái)建立在一張塑料圓盤 上, 像 CD 唱機(jī)旋轉(zhuǎn)唱片一樣旋轉(zhuǎn)圓盤, 利用離心力 和毛細(xì)管力來(lái)驅(qū)動(dòng)反應(yīng)中涉及到的溶液, 酶聯(lián)免疫 分析的每一步反應(yīng)的進(jìn)樣靠控制圓盤的旋轉(zhuǎn)速度來(lái) 自動(dòng)控制. 他們用該種裝置來(lái)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞中鼠 的 IgG 分析, 結(jié)果顯示, 與傳統(tǒng)的 96 孔板的分析相比, 該方法具有相同的檢測(cè)范圍但卻消耗更少的試 劑和更短的時(shí)間, 滿足了醫(yī)學(xué)診斷的需求.

規(guī)模集成化微流控芯片裝置不僅可以在微尺度 上實(shí)現(xiàn)常規(guī)生物學(xué)方法建立起來(lái)的檢測(cè)體系和技術(shù), 而且可以實(shí)現(xiàn)很多常規(guī)手段和技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)和達(dá)到 的研究. 比如：基因的表達(dá)與調(diào)控是生物學(xué)研究的核 心問(wèn)題之一, 不同水平的基因調(diào)控都涉及到特定蛋 白因子之間或蛋白因子與 DNA 或 RNA 之間的弱相 互作用, 傳統(tǒng)方法缺乏實(shí)現(xiàn)對(duì)弱相互作用進(jìn)行高通 量研究的手段. Quake 實(shí)驗(yàn)室[33]利用機(jī)械力限制捕獲 的方法展示了一種高通量微流控芯片平臺(tái), 用于測(cè) 定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能譜. 該芯片將氣動(dòng)微閥設(shè)計(jì)成 了紐扣形狀, 在下壓關(guān)閉時(shí)可以與下底面的位點(diǎn)直 接接觸而保留受較弱相互作用而結(jié)合的分子. 基于 此設(shè)計(jì)該研究組實(shí)現(xiàn)了對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 之間結(jié)合能譜的描繪(圖 9(a)). 該方法可以實(shí)現(xiàn)不同 轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 結(jié)合能測(cè)量的高通量與并行化, 為 理解體內(nèi)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子參與基因的表達(dá)與調(diào)控 提供了可參照的技術(shù)平臺(tái). 同樣利用該機(jī)械力限制 捕獲的設(shè)計(jì), Quake 實(shí)驗(yàn)室在集成化的微流控芯片 平臺(tái)上結(jié)合蛋白體外翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺炎鏈球菌 43 個(gè)蛋白之間相互作用的研究. 在兩個(gè)相鄰的微腔 室中, 各自在基底上采用核酸和蛋白的點(diǎn)樣, 其中一 個(gè)微管道中集成有紐扣式下壓微閥作為機(jī)械限制力, 在蛋白相互作用之后可以保留蛋白之間的弱相互作 用力和測(cè)定蛋白之間的親和作用(圖 9(b)). 該項(xiàng)研究 發(fā)現(xiàn)了很多肺炎鏈球菌中新的蛋白相互作用對(duì), 驗(yàn) 證了反饋調(diào)節(jié)在代謝調(diào)節(jié)中的普遍機(jī)制, 并且證實(shí) 某些蛋白在調(diào)節(jié)中扮演了多重調(diào)節(jié)角色.

Ｘ射線衍射法是研究蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的主 要研究手段, 如何快速得到高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體成為 結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)展的瓶頸. 高度集成化的微流控芯片 為蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的高通量、快速篩選提供了一個(gè)很 好的平臺(tái). 并且在微流體系的微小尺度下, 因密度差 異導(dǎo)致的自然對(duì)流可以忽略不計(jì)而自由擴(kuò)散成為物 質(zhì)交換的主導(dǎo)因素, 為蛋白質(zhì)結(jié)晶提供了一個(gè)非常 有利的動(dòng)力學(xué)環(huán)境. Quake 實(shí)驗(yàn)室[35]在大規(guī)模集成微 流控芯片制作的基礎(chǔ)上通過(guò)一系列微泵和微閥的集 成構(gòu)建了可以實(shí)現(xiàn)多種溶液方便定量混合與操縱的 芯片, 成為“自動(dòng)化配方”式微流控芯片裝置, 應(yīng)用該 芯片研究了木聚糖酶在不同沉淀劑配方條件下的晶 相變化. 該方法較之傳統(tǒng)方法的結(jié)晶篩選效率提高了 72 倍(圖 10(a)). 這一方法及之后的改進(jìn)與發(fā)展 已經(jīng)成功運(yùn)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中, 提高了獲取 晶體的成功率并節(jié)省了人力資源的消耗. Ismagilov 實(shí)驗(yàn)室利用油相將含有不同種類、濃度配比的蛋白 質(zhì)、沉淀劑和鹽溶液的水相分散成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的液體, 進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的高通量篩選, 并且該方法生成的蛋白質(zhì)結(jié)晶產(chǎn)物可以保存在毛細(xì)管內(nèi)直接進(jìn)行 原位Ｘ射線衍射分析(圖 10(b)). 在相似的液滴芯片中, 該實(shí)驗(yàn)室還利用蒸發(fā)擴(kuò)散的原理, 使水分子在 滲透壓的作用下從低鹽濃度的蛋白質(zhì)結(jié)晶液滴中擴(kuò) 散到高鹽濃度的溶液液滴中, 從而使結(jié)晶液滴中蛋白質(zhì)濃度逐漸升高達(dá)到飽和, 進(jìn)而形成結(jié)晶. 最近, 該實(shí)驗(yàn)室利用自由界面擴(kuò)散和“滑動(dòng)”芯片技術(shù)設(shè) 計(jì)了可以進(jìn)行大規(guī)模蛋白結(jié)晶條件篩選的實(shí)驗(yàn)[38]. 用 芯片上下兩層之間的相互滑動(dòng)控制可以實(shí)現(xiàn)預(yù)先分隔 開(kāi)來(lái)的蛋白溶液和沉淀劑通過(guò)自由界面擴(kuò)散混合, 大 規(guī)模的集成可以進(jìn)行多個(gè)蛋白樣品的平行實(shí)驗(yàn)和多個(gè) 條件的篩選. 該技術(shù)在芯片的設(shè)計(jì)上巧妙地利用了輸 送液體管道的寬度變化實(shí)現(xiàn)了同一條件下的不同反應(yīng) 平衡時(shí)間的選擇(圖 11), 為了解決在滑動(dòng)過(guò)程中有可 能產(chǎn)生的溶液滲漏問(wèn)題, 他們?cè)谛酒钠矫嫔衔g刻了 納米尺度的點(diǎn)陣列, 使得表面的疏水性大大提高, 這 樣就限制了溶液從管道和儲(chǔ)液池滲透出來(lái). 最終在 3 塊芯片上實(shí)現(xiàn)了的 480 個(gè)獨(dú)立的條件實(shí)驗(yàn), 每個(gè)蛋白 樣品僅消耗了 12 mL, 在芯片上成功結(jié)晶了烯酯酰輔 酶 A 水合酶和四氫葉酸還原酶. 這類“滑動(dòng)”芯片雖然 在結(jié)構(gòu)集成上比較簡(jiǎn)單, 但是在操作上集成了機(jī)械運(yùn) 動(dòng), 大大拓展了芯片的使用范圍, 值得關(guān)注.

圖 9 高通量集成微流控芯片中利用機(jī)械力限制捕獲弱相互作用保留測(cè)定和繪制轉(zhuǎn)錄因子和蛋白相互作用譜圖 (a) 集成 2400 反應(yīng)腔室和 7233 個(gè)微閥的芯片示意圖, 測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo) DNA 結(jié)合作用力的測(cè)定過(guò)程; (b), (c) 利用體外蛋白翻譯系統(tǒng)結(jié) 合芯片中限制捕獲弱相互作用保留研究蛋白間相互作用芯片示意圖和實(shí)際測(cè)定中的熒光照片

圖10 集成微流控芯片中研究蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的高通量篩選 (a) “自動(dòng)化配方”式微流控芯片裝置結(jié)構(gòu)示意圖與芯片實(shí)物圖, 微閥 與微泵的配合形成定量式的微注射于微混合器, 定量控制不同溶劑 與沉淀劑所占的比例; (b) 利用集成微流控芯片微液滴技術(shù)研究不同條件下膜蛋白的單晶形成和分子結(jié)構(gòu)

圖 11 滑動(dòng)微流控芯片進(jìn)行蛋白結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)[38] (a) 芯片實(shí)驗(yàn)過(guò)程示意圖; (b) 不同管道構(gòu)型和尺寸在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中控制蛋白結(jié)晶反應(yīng)平衡時(shí)間實(shí)驗(yàn)照片

以上實(shí)例均反映了集成微流控芯片在生物大分子研究中的獨(dú)特作用. 現(xiàn)代分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)通量越來(lái)越高、單個(gè)實(shí)驗(yàn)可以提供的樣品量越來(lái)越少、高 精度的重復(fù)勞動(dòng)所占比例逐漸增加, 這些都意味著 集成微流控芯片有望成為下一代的試管和多孔板, 成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)方法. 在實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo) 之前, 還有一些困難需要被克服: (1) PDMS 材料雖然大量被使用, 但是其表面容易吸附蛋白質(zhì)分子, 對(duì)某 些實(shí)驗(yàn)會(huì)帶來(lái)影響, 如何對(duì) PDMS 表面進(jìn)行改性, 或 者使用其他材料使其不容易吸附生物大分子, 是一 個(gè)重要問(wèn)題; (2) 芯片實(shí)驗(yàn)往往針對(duì)特定的實(shí)驗(yàn)需要 進(jìn)行芯片的設(shè)計(jì), 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的步驟和試劑多 變, 如何能夠設(shè)計(jì)一些通用性強(qiáng)的芯片, 可以很容易 的被生物學(xué)家們熱愛(ài)并使用, 是一個(gè)亟需解決的問(wèn) 題; (3) 如何在不斷簡(jiǎn)化操作與設(shè)計(jì)的同時(shí), 增加芯片處理的通量, 將符合后基因組時(shí)代利用微量樣品 進(jìn)行超大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的需求.

2.3 芯片上的化學(xué)合成

傳統(tǒng)的化學(xué)合成通常在燒瓶, 燒杯等大體積的 容器中進(jìn)行, 為了獲得更快的熱傳導(dǎo)、物質(zhì)擴(kuò)散和反應(yīng)過(guò)程, 進(jìn)一步提高反應(yīng)的選擇性, 人們開(kāi)始關(guān)注在 微反應(yīng)器中進(jìn)行化學(xué)合成, 而這種微量的化學(xué)合成 與生物醫(yī)學(xué)的需求正好吻合. 例如在核醫(yī)學(xué)影像檢查中, 一個(gè)重要的技術(shù)是正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(positron emission computerized tomography, PET), 該方法中常用的一個(gè)示蹤物質(zhì) 2-18 氟-2-脫氧葡萄糖 (2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose, [18F]FDG)的常規(guī)合 成需要訓(xùn)練有素的工作人員使用放射性藥物合成的 特殊設(shè)備, 花費(fèi)幾十分鐘的工作時(shí)間. 18-氟的半衰 期卻只有 110 min, 反應(yīng)過(guò)程不得不花費(fèi)的時(shí)間為該 技術(shù)的臨床應(yīng)用帶來(lái)了一些局限性, 例如需要加大 放射性原材料的劑量和使用更大規(guī)模的設(shè)備等等. Quake 研究組和加州大學(xué)洛杉磯分校的放射藥物學(xué) 家合作, 利用合理設(shè)計(jì)的微閥與微泵, 將[ 18F]FDG 合 成中的氟化物富集、脫水、標(biāo)記、脫乙腈、水解五步 反應(yīng)高度集成在微流控芯片上(圖 12(a)), 使[ 18F]FDG 合成全過(guò)程縮短至 14 min, 并將合成產(chǎn)物直接注射 入小鼠體內(nèi), 利用 PET 得到腫瘤分布的清晰圖像. 這一實(shí)驗(yàn)表明, 在芯片上實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成并非只是簡(jiǎn)單地在小體積反應(yīng)器內(nèi)重現(xiàn)反應(yīng)過(guò)程, 而是可以帶來(lái)更多的優(yōu)勢(shì).

由美國(guó)諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者夏普利斯(K. Barry Sharpless) 實(shí)驗(yàn)室發(fā)展出一項(xiàng)名為點(diǎn)擊化學(xué) (click chemistry)的新合成方法成為化學(xué)合成與藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng) 域的重要耦聯(lián)技術(shù)之一, 通過(guò)該方法能夠產(chǎn)生一系列 高立體選擇性的產(chǎn)物, 且其副產(chǎn)物無(wú)害. 反應(yīng)本身對(duì) 氧氣和水不敏感, 具有高效率和高控制性的特點(diǎn). 將 這項(xiàng)技術(shù)與集高通量、高度自動(dòng)控制等特點(diǎn)于一身的 集成微流控芯片結(jié)合, 美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校的曾 憲榮研究組選擇經(jīng)典的 bCAII 點(diǎn)擊化學(xué)體系, 在一塊 芯片上驗(yàn)證了同時(shí)進(jìn)行 32 個(gè)同位點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的高 效性和穩(wěn)定性, 并且極大的減少了珍貴樣品如蛋白質(zhì) 的消耗. 這一成功范例展示了微流控芯片在高通量 合成、篩選新型藥物產(chǎn)業(yè)中的潛力, 使得原先費(fèi)時(shí)、 費(fèi)力、費(fèi)錢的規(guī)模化合成實(shí)驗(yàn)以全新的方式來(lái)實(shí)現(xiàn).

2007 年, Quake 實(shí)驗(yàn)室[41]報(bào)道了利用全氟聚醚 (PFPE)材料通過(guò)集成微流控芯片實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量核酸合 成的結(jié)果(圖 12(b)). 在合成過(guò)程中, 需要使用到二氯 甲烷等對(duì) PDMS 材料有強(qiáng)溶脹能力的有機(jī)溶劑, 而 PFPE 材料對(duì)絕大多數(shù)有機(jī)溶劑具有很好的抵抗能力, 同時(shí)其力學(xué)行為和 PDMS 接近, 具有很好的彈性, 可 以利用多層鍵合的方式加工集成微流控芯片, 文章 以 DNA 合成為例, 演示了集成微流控芯片在多步復(fù) 雜有機(jī)合成中的潛在用途. 芯片上 DNA 分子的合成 和傳統(tǒng)方法相比沒(méi)有本質(zhì)的區(qū)別, 因其具有樣品低 消耗的優(yōu)勢(shì), 他們采用(1S)-(+)-(10-camphorsulf onyl)oxaziridine(CSO)作為氧化劑替代傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中使 用的廉價(jià)碘劑, 進(jìn)一步提高合成的準(zhǔn)確性. 利用化學(xué) 方法合成寡聚核酸分子, 是現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要 依托手段之一. 傳統(tǒng)的方法是采用商品化的核酸合 成儀通過(guò)設(shè)定不同的核苷按照一定次序逐步加成來(lái) 實(shí)現(xiàn)的. 這一方法發(fā)展到現(xiàn)在已經(jīng)非常成熟了, 采取 固相有機(jī)合成技術(shù), 每一個(gè)核苷的加成一共經(jīng)歷了 去保護(hù)、加成、氧化、封閉等 4 個(gè)化學(xué)反應(yīng)步驟, 4 個(gè)步驟完成一次的總產(chǎn)率一般都可以保持在 99%以 上. 在集成微流控芯片內(nèi)合成的寡聚 DNA 分子在分 子生物學(xué)的研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值, 首先產(chǎn)物 的量大小合適, 在 pmol 量級(jí), 特別適用于大部分分 子生物學(xué)實(shí)驗(yàn), 大大減少了原料的浪費(fèi)和廢液廢料 的產(chǎn)生; 其次, 通過(guò)合理的布局, 可以實(shí)現(xiàn)核酸文庫(kù) 的合成, 這對(duì)于高通量的生物學(xué)研究具有重要輔助 意義. 最近, Quake 實(shí)驗(yàn)室在 PDMS 上對(duì)上述合成 方法進(jìn)行了推廣, 在一塊芯片上同時(shí)進(jìn)行 16 個(gè)寡聚核酸序列的合成, 并通過(guò)連接酶將其拼裝成一段基 因. 這一技術(shù)對(duì)于合成生物學(xué)的發(fā)展將帶來(lái)重要的 技術(shù)支持, 利用微流控芯片進(jìn)行高通量 DNA 合成將 是這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì).

圖 12 集成微流控芯片用于化學(xué)合成的研究 (a) 規(guī)模集成式芯片用于操控液體在芯片中合成 2-18 氟-2-脫氧葡萄糖芯片核心結(jié)構(gòu)與過(guò)程示意圖[39]; (b) 用于合成寡聚核苷酸分子的集成式 PFPE 微流控芯片實(shí)物圖

集成微流控芯片進(jìn)入合成化學(xué)領(lǐng)域, 并不能取代現(xiàn)有的絕大多數(shù)有機(jī)合成所使用的容器和方法. 芯片上的合成化學(xué)必須適合于這個(gè)特殊的體系, 并可以利用這個(gè)體系帶來(lái)其他傳統(tǒng)體系無(wú)法提供的便捷或效率. 在組合化學(xué)、有機(jī)合成方法學(xué)、生物無(wú)機(jī)化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、核酸化學(xué)等相關(guān)的領(lǐng)域, 由于其 受到現(xiàn)有手段的很多制約, 是利用集成微流控芯片 尋找突破口的最好切入點(diǎn).

集成微流控芯片已經(jīng)成為深入分離分析、化學(xué)合 成、藥物微分析系統(tǒng)、分子免疫學(xué)、快速診斷系統(tǒng)、 分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、 結(jié)構(gòu)生物學(xué)、組織生物學(xué)、微生物學(xué)等一系列應(yīng)用研究領(lǐng)域的綜合性、多學(xué)科、多領(lǐng)域的交叉學(xué)科研究熱 點(diǎn). 大規(guī)模集成型芯片不僅可以實(shí)現(xiàn)許多化學(xué)和一 些傳統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化操作、檢測(cè)與分析, 而且可以大大減小樣品、試劑和時(shí)間的消耗, 極大地提高 實(shí)驗(yàn)的通量, 減少實(shí)驗(yàn)中廢棄物的產(chǎn)生. 更重要的是,集成微流控芯片不僅僅是簡(jiǎn)單地對(duì)傳統(tǒng)意義上的化 學(xué)或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行微型化的集成, 它提供了一種 全新的理念和技術(shù)平臺(tái), 使得原先在傳統(tǒng)的化學(xué)和 生物學(xué)手段下很難完成或不能完成的某些實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻靡皂樌貙?shí)現(xiàn).

（文章來(lái)源：科學(xué)通報(bào)，2011 第56卷 第23期：1855~1870 轉(zhuǎn)載僅為傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）