1.3 流體控制

芯片色譜是以微流控芯片作為載體的色譜系統,其核心-微流控芯片的關鍵功能就在于流體控制。高效的微流體控制是芯片色譜正常工作的基礎。進樣是色譜分析極為重要的一個步驟。進樣量過大會導致進樣時間過長、色譜柱過載、峰展寬等問題,嚴重影響色譜分離的效率。目前與高效液相色譜配套的進樣針的規格普遍在微升級別,而芯片色譜平臺需要控制納升級別的進樣量。因此,開發與芯片色譜相匹配的進樣系統顯得十分重要。芯片色譜進樣技術大致可分為電動進樣與壓力進樣兩類。其中,電動進樣無需泵閥結構、操作簡單的特點使其成為最早投入使用的方法(T型和雙T型電動進樣通道),同時也是目前最常用的芯片色譜進樣模式。Cong等開發了一種電動閥門式的芯片色譜進樣結構(見圖3a)。這種結構中有一個電驅動的可變型閥門,閥門兩側分別是進樣通道和色譜柱。在準備階段,在樣品通道與色譜通道兩端施加電壓,樣品先進入樣品通道,并由于閥門阻擋無法進入色譜柱。在進樣階段,閥門脈沖開關打開,樣品定量進入色譜通道,之后閥門關閉并開始色譜分離。電動進樣由于擴散、遷移率等問題,通常進樣誤差很大,很難做到定量進樣。相對的,基于機械手段推動樣品的壓力進樣方式可以實現高精度的定量進樣。但由于需要對流體額外施加壓力,壓力進樣需要更多泵閥結構提供支持。壓力進樣也可以通過分流的操作方式擺脫泵閥結構,從而實現簡單的定量進樣。Gáspár等在PDMS芯片上設計了一種分流進樣結構,由進樣口注入分流區的樣品會依據分流結構各通道的寬度比進行分流。通過控制進入色譜柱的通道與其他分流通道的比例就可以將進樣量精確地控制在納升級。但需要指出,分流式壓力進樣需要較大的樣品量,且不可避免地會造成樣品浪費。Ha等開發了一種特殊的“穿刺”進樣方法,他們直接將微升級的進樣針扎入PDMS芯片的通道中,之后用千分尺調節進樣針筒活塞位置實現“穿刺進樣”。由于千分尺精確的距離調節,這種進樣方式可實現3 nL體積的精準可重復進樣,且非常廉價、使用簡單。

圖 3   芯片色譜流體控制措施

芯片色譜泵可簡單分為芯片外置泵和芯片內置泵。早期芯片色譜泵直接沿用高效液相色譜設備使用的常規高壓泵。但由于芯片通道尺寸減小,這些常規泵在進行梯度分離時會發生嚴重的梯度滯后現象。因此,常規泵需要加入分流裝置來調整流速,以適應芯片色譜的工作條件。但分流在梯度分離中會造成嚴重的溶劑浪費,因此芯片色譜需要與其匹配的低流速高壓泵系統。在芯片外置泵中,能夠同時實現低流速和高壓力的最簡單的泵類型就是注射泵。Grinias等通過閥門切換梯度儲存流路與UPLC泵和氣動放大泵的連接實現了一種高壓注射泵結構。在準備階段,常規UPLC泵與梯度儲存流路相連,配制好的流動相被注入梯度儲存流路并保存在其中。在色譜分離階段,切換閥門使裝載有流動相的梯度儲存流路與色譜柱相連,啟動與梯度儲存流路相連的氣動泵,使儲存的流動相以一個較高的壓力注入色譜柱中完成分離。這一泵結構可以達到300 MPa的運行壓力。芯片內置泵的驅動方式以電驅動、電滲流和磁驅動為主,雖然也存在芯片內置機械泵,但蠕動泵、氣動泵結構在芯片上的加工難度較高,應用實例很少。最具代表性的芯片內置泵是電滲泵(electroosmotic pumps, EOP)。EOP有如下幾點優勢:

(1) 可直接集成到微流控芯片上;

(2) 可生成無脈沖液流;

(3) 可快速改變液流大小和方向;

(4) 沒有運動組件,可有效提高泵的穩定性和壽命;

(5) 在較大的背壓范圍內都可產生中低流速液流。

Wang等開發了一種高壓EOP芯片,該芯片泵的工作壓力約17 MPa,工作流速約為500 nL/min,該條件已足以支持芯片液相色譜的運行。該芯片由大量EOP基本單元組成,每個EOP基本單元由數個電滲通道并聯而成。每個基本單元再與其他單元串聯成整個EOP芯片,芯片泵可產生的液流壓力直接正比于芯片內含的EOP基本單元數量。

液滴技術作為一種新型的微流體控制技術也被應用到了芯片色譜上。Gerhardt等將液滴微流控技術與HPLC芯片無縫組合(見圖3b),在HPLC芯片色譜柱出口處耦合T型液滴生成通道。利用與色譜通道正交的油相切割水相色譜洗脫物,將洗脫物以45 Hz的頻率切割為大量體積約1 nL的液滴。靜態液滴內流體為層流狀態,具有低擴散、無返混的特點。因此將色譜洗脫物切割為液滴的過程,相當于將色譜分離的色譜圖譜切割成大量片段并進行保存,防止洗脫物返混合污染,最大限度地保留了分離分辨率。這一利用液滴保存色譜結果的技術也為洗脫物在柱后進一步的處理與分析提供了時間和空間條件。

1.4 檢測器

相較于常規色譜,芯片色譜需要更加靈敏、響應更快的檢測器。芯片色譜常用的檢測器可分為光學檢測器、電化學檢測器、質譜檢測器3類。紫外-可見光譜法是分析化學中應用最為廣泛的光學檢測手段,其簡單的結構使其在芯片色譜中有著廣泛的應用。但芯片通道尺寸相較常規色譜柱徑的大幅度縮小,使得芯片色譜通道的光程大幅縮小。這極大影響了紫外-可見光譜在芯片色譜上原位檢測的靈敏度(尤其是當通道寬度小于100 μm時)。因此,在芯片色譜上進行紫外-可見光譜檢測需要通過增大通道寬度或添加微結構(如光纖、波導管)等手段來增加光程,以提高檢測靈敏度。相比之下,熒光光譜的發射光強度與激發光強度成正相關,在使用激光這樣的強光源作為激發光源時(激光誘導熒光光譜,LIF),光程的減小對熒光光譜檢測靈敏度的影響幾乎可以忽略。熒光光譜主要局限于可自發熒光的物種有限,目前需要借助熒光標記和熒光染料才能做到廣泛應用。TPE熒光光譜利用兩個光子同時激發一個分子,可使分子達到更高的能級,從而讓一些原本不會發出熒光的分子產生熒光信號,該技術有望實現無標記的廣泛熒光檢測。Hackl等將電色譜芯片與TPE熒光光譜聯用(見圖4a),實現了芯片色譜平臺上的無標記時間分辨熒光光譜檢測。該芯片對多環芳烴的檢測靈敏度達到了nmol級。他們同時還證明了532 nm的TPE熒光光譜可以達到與266 nm單光子激發(one-photon excitation, OPE)熒光光譜相近的靈敏度。這意味著雙光子激發熒光光譜可在聚合物芯片等具有一定紫外吸收能力、但更容易制作的芯片平臺上使用,而無標記單光子激發熒光光譜則需要使用石英等低紫外吸收的芯片材料來保證檢測靈敏度。除了紫外-可見光譜、熒光光譜外,拉曼光譜、表面增強拉曼光譜也被嘗試應用于芯片色譜檢測器,并表現出可期的前景。

電化學檢測器是通過檢測電極表面電化學反應產生的電信號(電流、電壓)來進行分析檢測的手段。用于電化學檢測的電極可以很容易地進行微型化,并集成到微流控芯片平臺上。而且,電化學檢測的工作站已經可以做到小型化便攜式,因此電化學檢測方法也被視為實現便攜式芯片色譜的重要手段。電化學檢測方法在芯片色譜中的應用有一個限制因素:電極的使用壽命有限,需要經常更換;常見的微流控芯片在封裝后就無法再拆開,因此電極損壞后檢測芯片就只能報廢處理。Erkal等為解決這一問題,開發了一種3D打印的電化學檢測芯片。這種芯片在電極位置加工了螺紋結構用于可替換電極的固定;同時螺紋結構還滿足了芯片的密封需求,使得芯片多次更換電極也不會漏液。相比于常規電導、電勢檢測需要的電極與溶液直接接觸,電容耦合非接觸電導檢測(capacitively coupled contactless conductivity detection, C4D)不需要與待測溶液直接接觸,且電導檢測靈敏度極高,其作為微流控芯片檢測器更具潛力。Beutner等設計了一種C4D與質譜聯用的檢測方法,用于毛細管電泳分析檢測酚類物質。他們發現這兩種檢測方法具有較好的互補性:C4D檢測器對間甲酚具有極佳的靈敏度而對硝基酚敏感性不佳,而質譜檢測器則正好相反。

圖 4   部分芯片色譜檢測器

質譜法是基于不同質荷比的離子在電場加速后進入磁場中運動軌跡的不同,或在真空中飛行時間的不同,進行物質鑒定的檢測方法。質譜法的質量分辨本領使其具有極高的靈敏度和分辨率,以及超快的分析速度,同時還能提供豐富的分析信息。相比于光學檢測器和電化學檢測器,質譜檢測器顯然是三者之中結構最為復雜,成本最為昂貴的檢測器。但由于質譜法極高的靈敏度、微型化色譜與質譜極好的相容性以及質譜在組學研究中的重要地位,芯片色譜與質譜的聯用仍然是前沿的研究方向。芯片色譜與質譜聯用需要解決色譜出口與質譜離子源之間的耦合問題。目前常用的芯片色譜-質譜聯用離子源是ESI和基質輔助激光解吸電離離子源。ESI離子源因其廣泛的應用性和高靈敏度而成為與芯片色譜耦合最理想的離子源。Lotter等對玻璃芯片的ESI噴口進行了較為系統的探究。他們研究了4類ESI噴口形狀對質譜檢測效果的影響(見圖4b),發現在高流速(約400 nL/min)條件下4種芯片噴口沒有明顯的區別。但是在低流速(<50 nL/min)條件下,尖銳的ESI噴口(pulled和ground型)產生的電噴霧更加穩定,離子化效果更好。加工芯片ESI噴口需要較為精密的加工技術,一種更為簡單的噴口構建方法是在芯片柱上嵌入一段拉尖毛細管作為ESI噴口。Dietze等在制作聚合物芯片時,在通道中嵌入一段一端燒蝕拉尖的毛細管,成功與ESI源耦合。這種利用毛細管針尖制作噴口的方法特別適合于聚合物這類無法直接作為ESI噴嘴的芯片基底材料。MALDI離子源應用于微流控芯片上,可分為在線離子源和離線離子源兩類。人們已報道了數類微流控MALDI芯片,但帶有色譜分離功能的芯片色譜-MALDI-MS較少。Lazar等開發了一種新型的液相色譜-MALDI-MS芯片(見圖4c),該芯片以C18顆粒填料作為色譜固定相,在色譜柱通道的正交方向制作了大量與色譜柱通道相通的MALDI收集通道。在進樣并完成色譜分離后,洗脫物不再由色譜柱軸向洗脫,而是通過與MALDI收集通道相連的電滲泵結構橫向泵入MALDI儲液槽中,直接進行MALDI-MS檢測。由于MALDI收集通道被集成在色譜柱通道側向,進行洗脫物收集時相當于對色譜圖進行了切割和分段檢測,這使得該系統可以獲得優良的分辨率和檢測通量。

3 總結與展望

從歷史上第一個芯片色譜裝置誕生至今已近30年,但芯片色譜技術仍基本停留在基礎研究和科研實驗室里。相較于最初的期待,芯片色譜走向產業化的推進速度顯得些許緩慢。目前存在的主要瓶頸在于:芯片色譜技術對微型化、集成化的需求與芯片材料、工藝和設計發展現狀的矛盾。微流控芯片微型化、集成化主要通過縮小通道尺寸和增加通道總長度實現。對微納尺度流體,通道尺寸的縮小和長度的增加都會大幅增加流體阻力。現有的芯片基底材料承壓能力普遍在60 MPa以下,材料性質限制了色譜芯片微型化和集成化的進一步提升。這一瓶頸的解決在于發展新型的芯片基底材料,尤其是高強度和優良加工性的聚合物材料;同時也需要產業界形成相對統一標準的流體通道基本結構設計,以提高材料性能的利用度。此外,與芯片色譜匹配的外部設備微型化程度低,芯片接口技術尚不成熟,以及芯片色譜產業缺乏統一行業標準等,都有待學術界與產業界共同努力解決。但客觀地看,色譜微型化的趨勢已經十分明顯:毛細管色譜的產業化、微流甚至納流色譜的推廣及其在生物醫學分析中應用已日漸增多。作為色譜微型化另一途徑的芯片色譜,正式走向實際應用只是時間問題。芯片液相色譜極高的可擴展性、可集成性以及模塊化的優勢使其最有可能成為色譜這項技術走入便攜檢測(POCT)領域的方式,但這一理想還有待進一步提高芯片集成度和系統微型化程度才能真正實現。相信在不久的將來,“plug-and-play”的芯片色譜將成為現實。

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