近年來越來越多的證據表明，活性氧簇具有生長抑制效果，例如過氧化氫能夠導致氧化應激和細胞損傷，由于在人工生長培養基中產生了過氧化氫，導致微生物的生長效率明顯降低。雖然分子生態學和宏基因組學已經明顯增加了我們對于微生物多樣性的了解，并且引導產生了許多有趣的假設，但是這些先進的技術也顯示出我們距離充分闡明微生物多樣性還很遠。同時，考慮到許多基因儲存在具有未知功能或錯誤注釋的數據庫中，僅使用宏基因組學的方法不能提供足夠的信息去培養所有的微生物。實際上，只有通過細菌純培養的研究才能充分地闡述其表型和基因型。考慮到微生物培養在現代微生物學中的重要性，分離培養未培養微生物仍然是優先考慮的思路。因此，一個重要的挑戰就是如何克服目前存在的限制因素，擴大可培養的范圍。本文將綜述目前未培養微生物分離培養技術研究進展(表1)，為分離未培養微生物和研究其生態學功能提供參考。

1未培養微生物的限制因素

1.1 培養基組分和生長條件不全面

任何微生物的生長都需要能量、營養和適當的物理化學成分，并且不同的微生物所需的濃度是不同的。某些微生物在生長的過程中，需要特殊的營養物質、pH條件、培養溫度和合適的氧氣濃度。K?pke等研究不同的培養基基質和培養條件對微生物生長的影響后發現，不同的條件下微生物生長出現明顯差異。

1.2 忽視了環境中微生物之間的相互作用

自然環境中的大部分微生物都是群體生活，并且相互之間建立了復雜的關系。在實驗室培養條件下，單純地將待培養的微生物與其他相關的微生物群體分開，物種之間的信息交流被阻斷，微生物因缺乏必需的生長因子和信號分子而無法生長，表現為不可培養。在原核生物中，種間互作普遍存在并且不會受到信號分子的限制，例如自體誘導分子2(AI-2)和N-酰基-高絲氨酸內酯。

培養時間短

在某些情況下，培養效率隨著培養時間的延長而明顯增加。許多微生物，特別是生活在營養不充足環境中的微生物生長速率是很慢的。因此，延長培養時間是提高這類微生物培養效率的先決條件。Davis等培養土壤微生物至少12周的時間，結果顯示菌落計數明顯增加并且分離出幾株之前未培養的菌株。

檢測靈敏性受限

對于某些微生物生長速率慢、產量低的情況，如果檢測技術靈敏性不高，很可能得出錯誤的結論，因此開發多種高靈敏性檢測方法對于認識未培養微生物具有很大的作用。對于要通過菌落數量來研究其生理生態特性的微生物，高靈敏性的檢測方法如切向流過濾是極其重要的。

2未培養微生物培養分離技術

2.1調整培養基

在生長的過程中，許多微生物有特殊的營養物質和化學物質的需求。這就需要對微生物生存的自然環境和特性有深刻的理解，包括與培養基生長直接相關的各種因素，才能有助于研究者更好地理解這些因素并進一步開發培養未培養微生物的方法。最近的一些研究探究了不同成分和濃度的培養基對于培養未培養微生物的影響。Li等應用體外培養方法，在厭氧培養基中添加十八碳烯酸(TVA)至不同終濃度(0、30、40、50、60μg/mL)，接種瘤胃微生物后進行連續和傳代培養，傳代富集培養時，用DGGE監測菌群變化，發現當傳至第4代，TVA氫化菌群的數量增加最顯著，對差異條帶的測序結果表明這些細菌大多屬于未培養的瘤胃細菌。Davis等和Sait等參考系統發育相關菌種，通過修飾和富集培養基成功地分離出之前未培養的微生物。微生物學家通過在培養基中加入氫氧化鐵和錳氧化物作為電子受體，實現了微生物的高效培養，例如變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、疣微菌門和鹽單胞菌門。Kashefi等根據嗜高熱微生物利用Fe(III)作為終端電子受體這一高度保守的特性，在培養基中添加非常微量的Fe(III)氧化物。該方法的前提是對微生物特性有一定的了解。Santini等從Aodaliya金礦中分出以亞砷酸為電子供體，氧為受體，以CO2為唯一碳源的優能自養菌(NT-26)，16SrRNA基因序列分析表明，NT-26屬于α-Proteobacteria土壤桿菌的一個根瘤菌分支，可能是一新種。一些研究關注甲烷厭氧氧化對于硫酸鹽或硝酸鹽的還原作用。這些方法需要精確的培養基，其中包括碳氫化合物能量來源和硝酸鹽，鐵和硫酸鹽作為電子受體。

對來自北海的樣本進行的研究顯示，碳源的品質是決定培養效率的關鍵因素。包含不同碳源和復雜化合物的培養基所培養出的微生物數量和多樣性比只含有一種碳源的培養基更高。相反地，許多自養微生物不能在只有一種固定碳源的培養基中生長。目前，通過使用低底物濃度的培養策略，針對未培養微生物的培養已經取得一些成效。放線菌門、酸桿菌門、變形菌門和疣微菌門利用低營養培養基和增加培養代數進而被成功地培養。改善培養條件(如營養水平，氧氣濃度，腐殖酸的添加和信號分子)也增加了一些新型微生物。最近，科學家創新地開發出高選擇性培養基，最大的優勢是該培養基對特定的微生物具有高選擇性。這種方法被用來開發選擇性培養基培養水稻細菌性谷枯病菌、燕麥食酸菌、果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌(表2)。在培養基中添加腐殖酸、信號分子、處理活性氧的酶類或移除某些抑制因子提高未培養微生物的培養性。一些微生物學家證實吉蘭糖膠對于未培養的微生物的培養和分離是有效的，因為它的平板成分比瓊脂要更清楚，因此更容易找到非常細微的菌落。吉蘭糖膠也可能增強受瓊脂抑制的微生物的生長。吉蘭糖膠培養基上的菌落計數是瓊脂培養基的10倍。生長在吉蘭糖膠培養基上大約60%的微生物被認為是新的，在同樣的條件下，新分離得到的微生物中的一半在瓊脂培養基上不能形成菌落。

2.2群體培養

2.2.1共培養

在自然環境的微生物區系中，微生物間的相互作用對于群體生存是至關重要的，但是由于內在的復雜性和實驗室培養的困難性，這些相互作用間的確切機制仍然是不清楚的。傳統的以培養為導向的研究并不能解釋由信號分子介導的相互作用，這些信號分子嚴重地限制了對于未培養互養微生物的研究。因為微生物總是會在一個群體中與其他微生物建立一種關系，并且這些相互作用一方能夠競爭有限的資源，另一方面也會通過代謝物和信號分子的交流進行合作。微生物之間相互交流的典型的例子比如生物膜和多細胞培養裝置，都可以實施單個物種培養不可能實現的多功能培養。例如，混合細胞組合能夠完成多級纖維素降解，并且產物中間體能被作為碳源進行利用。Park等開發了一種簡易的微液滴裝置用于高效培養互養微生物群體，同時來證明其在微生物間協同共生中的效果。微液滴裝置是單分散液滴中封裝和培養微生物群體中的小單元。如果液滴將有互作關系的微生物局部化，那么這些微生物將能夠分裂生長(圖1A)。傾斜的T形連接用于液滴的產生，反應室用于保留液滴進而進行培養(圖1B，C)，這個傾斜的T形連接能夠產生均勻分散的液滴，在入口的壓力下，至少1400個液滴能夠被非常緊密地包裹在10mm×5mm的反應室內(圖1D)。

共培養也是一種培養兼性或互養微生物的有效方法。到目前為止，兩種成功的例子已經被報道：(1)一種利用透析膜反應器的群體培養方法已經成功地從厭氧淤泥中培養出厭氧嗜熱的降解谷氨酸的微生物。(2)另一種利用在厭氧和需氧交替的間歇反應器中的群體培養成功富集到混合微生物。新的微生物通過與耗氫型微生物共培養或使用適合生長的純培養基質得以成功地鑒定。另外，在很多情況下，不同技術結合使用已經取得了成功。例如，通過將適合生長的環境條件與輔助菌株結合使用，Nichols等培養出一種新的嗜冷桿菌屬。輔助菌株提供了必要的生長因子，這些生長因子對于使用人工培養基培養未培養菌株是重要的發現。其他的研究者已經使用非共生的變形蟲作為一種工具來分離環境樣品中(包括土壤)新的胞內微生物[40]。

圖1用于共培養的微流體裝置

注：A：利用共培養空間檢測微生物間的共生關系；B：微流體裝置原理圖；C：微流體裝置實物圖；D：微流體裝置內液滴形成反應室.

2.2.2原位培養

模擬目標微生物的自然環境進行原位培養和分離是目前研究者的一個基本策略。Kaeberlein等模擬海洋微生物自然生長的環境，設計出名為擴散生長盒(Diffusiongrowthchamber)的自制培養儀器(圖2)，使用這種儀器來分離培養微生物。該擴散盒由一個環狀的不銹鋼墊圈和兩側膠連孔徑為0.03μm的濾膜組成，濾膜既允許有益的小分子代謝物質和圈內外微生物產生的活性物質透過膜自由進出小室，化學物質在盒內和環境之間進行交流又不能讓微生物細胞通過造成逃逸，因此使高密度培養成為可能。擴散盒內加入被分離的環境樣品即海洋微生物樣品與瓊脂的混合物，封閉后置于模擬采樣點環境條件的玻璃缸中進行培養，并不斷注入新鮮的海水循環流動。1周后，培養基上產生大量形態各異的微型菌落，數目高達接種微生物的40%，微菌落中多數為混合培養，需再次分離以獲得純種。最后從海水中分離到一株新的菌株。不同類型膜基系統已經被開發出來在自然環境中直接生長微生物群體。來自土壤、海洋或活性污泥中的未培養微生物被培養在擴散生長盒中。據此得出了這種假設：在擴散生長盒里環境中原位培養的原核生物一方面進行充分的菌株富集為了隨后的分離并移入傳統的固體培養基，另一方面在試管培養條件中使菌株適應抑制性的條件。有趣的是，很多緩慢生長的菌落應用該方法也可以被成功培養。研究者已經在模擬的自然環境中通過使用擴散生長盒測試了未培養微生物的培養性并取得了成功的結果。在此基礎上，科研人員開發了一種新的高通量平臺用于大量培養和分離環境中的未培養微生物，這種平臺被稱為分離芯片(Isolationchip，Ichip)。Ichip由數百個微型擴散室組成，每個室可接種單個的環境細菌。通過這種方法，使研究者研究那些不能人工培養微生物成為可能。這種方法的合理性在于，可以讓一些自然生長因子通過擴散進入到培養室內，從而有助于培養室內的細菌生長。結果表明，通過這種方法分離到的細菌大大超過了傳統分離方法得到的細菌。Nichols等設計并測試一種分離芯片(Ichip)(圖3)，先把中央平板浸到目標細胞懸液中進行培養，進而轉到瓊脂培養基中，等培養基冷卻后固定下來，平板兩邊附上薄膜經過擠壓彼此分開(圖3)。通過這種芯片分離得到約40%海水微生物種類和50%土壤微生物種類，其中海水樣品中具有62個(28.3%)、土壤樣具有86個(28.7%)純培養微生物的16SrRNA基因相似性小于95%。這個方法可以用于大量且多樣性高的微生物的分離培養。Jung等開發了一種新技術，采用I-tip方法使微生物和自然界的化學物質混合稀釋進而能夠讓微生物在自然環境中利用這些物質生長，利用原位培養手段培養出更具多樣性的微生物群體，縮小了可培養和未培養微生物間的距離。

圖2擴散生長盒原位培養環境微生物示意圖

注：A：擴散室是由兩個0.03μm的聚碳酸酯膜及夾在二者之間的墊圈組成的；B：生長擴散室被培養在海洋沉積物的表面.

圖3分離芯片原位培養微生物的示意圖

注：A：將有多孔的中央平板浸到目標細胞懸液中進而捕獲單細胞；多孔中央平板的局部放大圖；分離芯片裝配：上下兩邊帶有多孔的中央平板通過薄膜擠壓中間的平板；B：螺絲用來密封多孔內的細胞；C：分離芯片裝配：上下兩邊帶有多孔的中央平板通過薄膜擠壓中間的平板，螺絲用來密封多孔內的細胞.

2.3細胞捕獲

2.3.1單細胞捕獲分離

單細胞捕獲分離技術是指利用拉曼光譜儀等設備對特征細胞進行分離，進而對其功能進行研究。Wang等通過優化光路、提高激光強度等方式顯著提高了單細胞拉曼光譜的采集速度，首次將微生物細胞拉曼圖譜獲取時間降低到毫秒級，為高通量單細胞拉曼分選奠定了基礎。同時，結合激光誘導向前轉移(LIFT)原理，發明了拉曼激活細胞彈射(Raman-activatedcellejection，RACE)技術，可用于將特定拉曼表型的單細胞從復雜微生物群落中分離，從而獲取其基因組信息。研究人員一直是通過利用如宏基因組學研究等方法來發現一些生物體，探討生活在環境中的微生物群體，它們通常難以或不可能在實驗室中進行培養。然而利用單細胞測序，科學家將來自單個細胞的DNA擴增10億倍，破譯了它的基因組，從而為研究從前未知的“微生物暗物質”開辟了一條新途徑。美國能源部下屬聯合基因組研究所的譚佳·沃克領導的研究團隊選擇了201種微生物和古生細菌的細胞，并閱讀了其部分基因組(從10%到90%不等，取決于不同細胞)。這些微生物來源于9種不同的生存環境，包括海底熱水流火山口以及地下金礦等，沒有一種曾被測序或在實驗室內培養過。研究人員通過選擇高度多樣化的微生物，測定了部分的基因組序列(范圍從低于10%到高于90%，這取決于細胞)，來嘗試探索這些暗物質(圖4)。通過序列闡明了這些微生物之間，以及與其他物種之間的關系。在新數據的基礎上，作者提出了對古生菌域和細菌域的分類修正，包括提議將古菌重新歸入三個“超級門”。通過應用單細胞捕獲分離技術能夠直接分離單細胞，進而研究細菌多樣性。

2.3.2熒光激活細胞分離技術

流式細胞術是一種熒光依賴的細胞表征技術，也被廣泛用來進行微生物細胞的分離。單個細胞在強光源(激光或激光二極管)前面通過時，可以利用單個細胞的特性(如大小、形狀、細胞熒光信號等)快速分析整個細胞群體。當把特異的熒光信號(如FACS)與細胞分選結合起來后就可以對來自復雜環境樣品的大量細胞進行快速分析，如含有FISH探針的個體就能夠從這個群體中被分揀出來。Ozawa等利用流式細胞熒光分選技術(FACS)從水樣中檢測和分離低濃度的微生物，有31種致病菌被分離出來[48]。Podar等對不可培養的TM7生物門的細菌群體進行研究。他們利用原位熒光雜交技術和流式細胞術結合的方式對土壤樣品中的單一細胞以及小批量細胞(5?100個)進行分離，接著對一些屬于TM7門的細菌基因組片段進行擴增測序，發現采用該方法可以從土壤群落中篩選到低頻率(0.02%)的靶細胞，表明該方法可以用來識別和分離群落中“無法看到的”稀有物種的代表性微生物[49]。

圖4單細胞測序工作流程

注：A：每個細胞裂解后進行基因組擴增產生3300個成功的擴增序列.大部分屬于新譜系的單一擴增基因組被用于基因組測序和草圖組裝，最終得到201個基因組草圖.

Kvist等從環境樣本提取細胞后，使用Cy3標記的探針進行熒光原位雜交。用顯微操縱器將標記有明亮螢光信號的單細胞分離，并用單個分離的細胞作為多重置換擴增的模板(圖5)。多重置換擴增的產物隨后用于16SrRNA基因序列分析。結果顯示>99%16SrRNA基因與土壤泉古菌SCA1170分支具有同源性。用此方法分離了一株土壤泉古菌。但是應用該方法有兩個限制因素，一是存在序列偏差，盡管各種改進的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真性及高特異性的擴增仍然是亟待解決的問題；二是由于核糖體RNA很強的進化保守性，從而導致以其為基礎的系統發生分析的分辨率比較低，如16SrRNA基因就無法完整地表征菌株(基因型)的特性。因此，我們必須進一步改進這種技術的操作過程，以尋求更為有效的方法來減少非靶向生物體及外源DNA的污染等情況的發生。另外，對測序得到的大數據的分析也是一個重大的挑戰。

圖5利用熒光原位雜交進行單細胞分離和擴增的原理圖

注：A：探測到特定的目標單細胞后被顯微操縱器分離，其基因組作為模板利用多重置換擴增技術用于基因組擴增.

2.4高通量分離培養

2.4.1培養組學

培養組學是一種通過增加培養條件來檢測細菌多樣性的高通量方法。首先利用血液培養基富集，隨后在瓊脂培養基中進一步培養。在這一過程中，確認了3種成分是必需的：在血液培養瓶中預培養(分離到56%的新菌種)、瘤胃液的添加(分離到40%新菌種)以及羊血的添加(分離到25%的新菌種)。Lagier等借助微生物培養組學(Culturomics)，綜合多重培養條件、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)及16SrRNA基因測序技術，極大地改善了培養條件，增加了可培養微生物的數量。同時，選擇最佳的培養條件來增加研究樣本的數量和應用新的實驗方法(新鮮樣本的接種；小菌落的檢測和變形菌門、微需氧菌和嗜鹽性的原核生物)來解決之前研究存在的不足。通過這種方法，鑒定出1057個原核生物物種，其中531種屬于人體腸道菌群；利用培養組學，首次分離得到的腸道微生物種類至少增加了一倍(圖6)。

圖6培養組學工作的原理圖

注：A：培養組學是一項綜合多重培養條件、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)及16SrRNA基因測序技術.

2.4.2微液滴培養法

Zengler等設計了一個非常精妙的方法，將細胞包埋在凝膠微滴板中，在低營養的流動培養液中進行培養，再用流動血細胞計數法檢測微滴板上有多少個微克隆(圖7)。這是一個開放流動的系統，微生物間的代謝產物及信號分子可在凝膠空隙中進行擴散而被其他菌利用。這與自然環境有很多的相似之處，因而新培養出來的微生物種類也大大增加。這種方法可用于土壤和海水等環境，并且能夠在每個環境樣本中分離得到10000多個細菌和真菌。Jiang等借助微液滴平板劃線技術研究微生物的多樣性。從多環芳烴富集的土壤微生物群落中分離培養單細胞，得到4個分枝桿菌分離株和1種之前未知的降解熒蒽的芽球菌屬。該方法與之前的微液滴方法相比，不需要昂貴的自動化設備來產生微液滴，并且操作簡單易行。此外，通過組合油相載體，這個方法能夠被應用到其他方面，例如將油脂、石油和能溶于油相的疏水性底物，例如不溶于水的除草劑、殺蟲劑和其他疏水環境污染物結合，能夠分離和識別具有生物修復和生物轉化的環境微生物。美國東北大學的工程師EdgarGoluch和生物學家SlavaEpstein開發出一種微型納米設備，用來從物種混合物中捕獲單個細菌細胞，產生這些細胞的純培養可以解決微生物培養中的局限性。這種新型設備可以使單一的細菌細胞通過通道進入到包含有細菌“食物”的小室中，而細菌細胞進入的顯微通道，僅比細菌細胞稍窄一些。因此，當進入一個細菌細胞后，就可以阻斷其余細胞的進入。在小室中細菌的細胞就可以開始增殖，當其增殖到純種樣本并且充滿整個箱體后，研究者就會對其進行收集和鑒定。該設備的優勢是養料室的收縮尺寸和營養成分可以動態調整，進而增加捕獲細胞的多樣性，或者優化特定性狀物種的分離。

圖7基于單細胞包埋在凝膠微滴板中的高通量培養方法流程圖

注：A：將細胞包埋在凝膠微滴板中，在低營養的流動培養液中進行培養，再用流動血細胞計數法檢測微滴板上有多少個微克隆.

2.4.3生物反應器培養法

Amanullah等采用目前一種新型的自動化小規模生物反應器，通過構建適宜的pH、溶解氧和葡萄糖的條件進行流加培養，能夠成功地模擬搖瓶和生物反應培養條件，相較于傳統方法可以實現更高濃度的活細胞培養，濃度至少可達12×106cells/mL。為了能夠從貧營養海洋生態系統中培養未培養微生物，Connon等利用高通量培養方法在低營養培養基中進行分離培養。研究人員使用將微量滴定板和新開發的細胞芯片相結合的方法，檢測限能達到103cells/mL。從近岸海水中收集的樣本中，至少14%的細胞利用這個方法能夠被培養。與傳統的微生物培養方法相比，培養的數量要高14?1400倍。在培養出的微生物中，4種獨特的細胞譜系屬于之前未培養的海洋厚壁菌門。這個方法在培養已知的海洋克隆文庫中未培養的海洋浮游微生物是有效的。

3未培養微生物應用前景

未培養微生物在自然環境微生物群落中占有非常高的百分比(約99%)，無論是其物種類群，還是新陳代謝途徑、生理生化反應、產物等方面都存在著不同程度的新穎性和豐富的多樣性，因而其中勢必蘊含著巨大的生物資源，具有非常可觀的應用前景。首先，在生物降解方面，廈門大學微生物研究所的實驗室從在生態環境中尋找未培養微生物及其降解基因的角度出發，應用宏基因組技術構建文庫，在尋找抑制赤潮藻類的相關基因及PAHs高效降解基因已進行了大量研究，已取得初步研究成果，期望在未培養微生物中尋找高效功能基因并應用于污染的生態環境治理。其次，在藥物篩選方面，Ouyang利用瓊脂糖凝膠包埋法從中國南海的多種海綿中分離得到超過400kb大小的細菌DNA片段，并用獲得的大片段DNA構建了海綿Halichondriasp.的BAC文庫。此外，在酶類資源發掘方面，多位科學家利用功能性篩選可以快速地從多個克隆子中鑒定出全長基因，并由此獲得這些功能基因的產物，為工業、醫藥和農業提供一些新的天然活性物質如各種酶類及一些次生代謝產物等，包括4-羥基丁酸脫氫酶、N-酰基酪氨酸合成酶、幾丁質酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶等。

4總結與展望

目前為止，因為單純的基因測序無法解答微生物群落功能和代謝，因此，分離未培養微生物的方法越來越受微生物學者關注。然而，傳統的方法存在分離效率低、操作復雜、設備昂貴或缺乏群體交互作用等缺點，難以分離特定功能微生物(群)。因此，本文綜述了改良培養基、共培養、原位培養、單細胞捕獲分離、熒光激活細胞分離技術、培養組學、微液滴培養法等新方法，并且提出必要時可幾種培養手段相結合，優勢互補，從多個角度對未培養微生物進行分離培養。同時，我們要發掘未培養微生物豐富的基因資源，發現新的酶類和化合物。基于以上研究現狀，筆者認為，未來還應在以下幾個方面加強研究：

（1）筆者實驗室從事瘤胃微生物分離培養研究工作多年，在厭氧滾管技術和調整培養基等方面均進行了很多探索，目前通過富集培養已成功從奶牛瘤胃中分離得到具有TVA氫化能力的微生物菌株一株；從瘤胃壁上分離得到地衣芽孢桿菌和奇異變形菌，從瘤胃液中分離獲得白色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌和布氏密螺旋體，總共5種尿素分解菌，為進一步認識瘤胃微生物提供理論依據和方法基礎。同時，我們實驗室發明了一種基于短序列的引物設計來定量差異細菌的方法，并成功運用了基于短的16SrRNA基因序列設計的引物定量目標未培養細菌，結果發現與飼喂混合粗飼料的奶牛瘤胃微生物相比，飼喂秸稈粗飼料的奶牛瘤胃中顯著減少的未培養細菌R-UB來源于Succinivibrionaceae，有助于我們通過針對性地調控瘤胃微生物來更好地利用秸稈粗飼料資源。此外，我們利用自主研發的人工瘤胃模擬系統，以尿素和脲酶抑制劑(乙酰氧肟酸)分別作為尿素分解菌的激活劑和抑制劑，通過高通量測序技術研究細菌16SrRNA基因變化，揭示瘤胃優勢尿素分解菌群。最終揭示了瘤胃優勢尿素分解菌：Pseudomonas、Streptococcus、Haemophilus、Bacillus、Neisseria、Actinomyces和Succinivibrionaceae[60]。該研究解決了純培養難題，這對于胃腸道重要功能菌群的鑒定提供了新的研究思路。另外，奶牛瘤胃尿素分解菌群的鑒定，為調控瘤胃尿素代謝和提高尿素氮利用率提供了新的調控靶標。但是一方面由于我們仍然缺乏對微生物的多樣性、生存環境以及在生物進化中地位的認識，無法設計微生物生長的原位環境實現群體培養，導致依賴其他微生物的代謝活動或者其他環境條件中的微生物不能生長。另一方面，緩慢生長的或稀有的微生物經常在培養和測序的過程中被豐度相對高的微生物所掩蓋。因此還需繼續加強對微生物生理環境的分析研究，解析影響未培養微生物不能培養的關鍵營養因子。

（2）雖然以共培養、原位培養、單細胞捕獲分離、熒光激活細胞分離技術、培養組學、微液滴培養法等為代表的分離培養技術近年來迅速發展，但一些常規方法(如傳統微生物培養法、厭氧滾管技術、改良培養基等)也不能完全摒棄。應該將多種技術相結合，為探究環境中微生物分布和多樣性，解析不同環境條件下微生物生態功能，挖掘環境中未培養微生物，更新和完善微生物數據庫等提供新的方法學支持。

（3）必須全面理解微生物生理適應性與群體行為，發展和革新培養技術，改變微生物培養方式，設計盡可能接近微生物生活的自然環境，培養出更多的“不可培養微生物”，推動來源于未培養微生物的新基因、新活性物質和天然產物等資源的挖掘利用。

文獻來源微生物學通報DOI:10.13344/j.microbiol.china.170356作者：邢磊趙圣國（轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）