金孝偉李哲煜徐翩翩張笑顏任南琪

庫里連科·維塔利孫凱(哈爾濱工業大學環境學院,城市水資源與水環境國家重點實驗室,哈爾濱150090)(圣彼得堡國立大學地球科學研究所,圣彼得堡,俄羅斯聯邦199034)

摘要

發光細菌能夠發出波長為450~490nm的可見光,其發光強度隨待測溶液中毒性物質濃度增加而減弱。發光細菌法具有簡單、快速和高穩定性等特點,被廣泛應用于水質急性毒性分析。近年來,隨著微流控技術微型化、集成化和自動化的不斷發展,基于微流控技術的發光細菌毒性分析裝置的研究越來越多。與傳統方法相比,微流控型生物傳感器所需菌液少,可以有效地避免人為誤差和外界條件干擾等,靈敏度更高。本文結合發光細菌的特點和發光機制,對微流控型生物發光傳感器及其在環境監測中的應用進展進行了評述。

1引言

隨著環境污染的日益嚴重,當今社會對環境污染物的監測需求不斷增加。環境中的毒性物質種類繁多,化學、物理以及生物檢測方法被逐步建立,其中建立較早的是化學方法,檢測體系相對完善,可實現大多數污染物的定性和定量檢測,但該方法只能獲得所測污染物的成分及濃度,無法直觀反映該污染物對生物體的毒性效應。物理方法過程復雜,設備昂貴,多用于大氣和大面積水域污染的遙感監測。生物分析方法利用生物體如微生物、植物、無脊椎動物和魚類等對環境中的毒性物質變化進行評價,其中,基于微生物的生物分析方法因其簡便快速、重現性高等優點被廣泛應用于水質毒性檢測。

發光細菌是一種在暗室中能發出肉眼可見的藍綠光的細菌,常用于水質毒性檢測。發光細菌的生物毒性檢測依賴于其對環境中污染物的反應,能夠體現污染物對生命個體的影響[1]及毒性效應[2],具有簡便快速、操作簡單、重現性好等優點。因此,發光細菌的生物毒性檢測被用于各種環境污染物的毒性分析。Westlund等[3]研究了十余種農藥對費氏弧菌的急性和慢性毒性,發現部分農藥15min和30min的EC50值相差幾十倍,說明僅考慮15min的EC50值容易低估某些污染物的毒性。Liu等[4]以青海弧菌為受試生物,研究了6種農藥的單一及二元聯合毒性,發現二元聯合毒性是否高于單一物質毒性主要取決于兩種物質間的相互作用,如拮抗效應使聯合毒性下降,協同效應使聯合毒性增強等。Ding等[5]研究了6種鄰苯二甲酸酯及二價鎘對青海弧菌的毒性作用,指出這6種鄰苯二甲酸酯與鎘的二元聯合毒性均表現為相加效應。發光細菌也常被用于評價新型材料的生物毒性。Rossetto等[6]利用費氏弧菌測試了納米CuO顆粒與微米CuO顆粒的急慢性毒性,研究結果表明,納米顆粒的毒性高于微米顆粒的毒性,為納米毒理學研究提供了一種方法和便利工具。Costa等[7]通過一種全自動流動注射分析系統研究了7種離子液體對費氏弧菌的毒性作用,指出離子液體的毒性作用與其結構和組成有關,若陽離子含有苯環,其毒性大于不含苯環的結構,而陰離子中含氟結構的毒性大于不含氟結構。

近年來,基于發光細菌的生物毒性檢測方法與微流控技術結合,使發光細菌的生物測試方法不斷向便攜化、集成化和智能化方向發展。微流控技術是在較小的芯片上完成進樣、反應、檢測于一體的分析裝置,具有快速、高效以及耗能低等優點。研究人員將基于發光細菌的生物測試方法與微流控技術相結合,構建出新的生物發光微分析系統,主要由三部分組成:(1)微流控芯片,含有微室陣列和微通道;(2)微室內的活細胞,用于感知目標物質并反饋為生物發光信號的變化;(3)轉換器,將生物發光信號轉換為電信號。基于發光細菌的發光原理以及微流控的技術思想,本文對基于發光細菌的微流控型生物傳感器的原理及應用的研究進展進行了評述。

2發光細菌及其發光機制

發光細菌分布廣泛,主要存在于海洋中,是一種能夠發出微弱藍綠可見光的細菌,其最大發射波長在450~490nm之間[8],屬革蘭氏陰性、兼性好氧型細菌[9]。目前,已知發光細菌分為4個屬:弧菌屬(Vibrio)、發光桿菌屬(Photobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和光桿菌屬(Photorhabdus)[10],其中典型菌,如明亮發光桿菌、費氏弧菌和青海弧菌等被廣泛應用于毒性分析。

發光細菌中存在由NAD(P)H:FMN氧化還原酶和熒光素酶組成的酶系統,當黃素酸(FMN)、輔酶域[NAD(P)H]、八碳以上的長鏈脂肪醛(RCHO)和分子氧(O2)存在時,酶系統發出約490nm的光,反應方程式如下:

細菌熒光素酶是一種單加氧酶,能將分子氧(O2)中的一個氧原子轉移到還原型黃素單核苷酸(FMNH2)上,使其氧化成黃素單核苷酸(FMN),另一個氧原子加到長鏈脂肪醛(RCHO)結合生成相應的長鏈脂肪酸。熒光素酶自身無法催化黃素的還原,因此需要借助輔酶域[NAD(P)H]催化,完成生物發光過程。由于FMNH2/FMN也作為細菌呼吸代謝的重要參與物質,所以細菌的發光反應可看作是呼吸作用中電子轉移到氧分子的一個代謝旁路,可以調節還原型黃素單核苷酸的水平。在能量代謝或分解代謝的脫H反應中,輔酶玉(NAD)接受H之后必須將H轉給FMN,將其還原為FMNH2后方能進入呼吸產能階段。此時,細菌熒光素酶類似一個黃素單加氧酶,或是一種平衡功能的氧化酶,能減少還原型黃素單核苷酸的生成,增加電子代謝通路的還原功能,因此對細胞代謝是有利的[11]。分子氧與還原型黃素單核苷酸生成熒光素酶鄄黃素過氧化物,該過氧化物降解產生的能量生成單線態的激發分子,并在退激時發射光子。通常,過氧鍵斷裂后被兩個更強的化學鍵取代,并伴隨著能量的產生,部分能量用于生物發光。

3基于發光細菌的微流控系統

發光細菌接觸污染物后,酶系統受到破壞或者細胞死亡都會導致其發光強度下降。部分污染物能夠與發光細菌的熒光素酶結合,從而干擾細菌的生物發光過程;有的污染物則是通過破壞細胞表面的感受器,擾亂細胞膜功能,甚至與細胞組分發生化學反應,導致細胞失活從而降低發光強度。因此,根據污染物對發光細菌發光強度抑制作用的不同,發光細菌可以用于評估污染物的毒性效應[12]。

自Karube提出生物傳感器的概念[13],生物傳感器在環境污染物檢測方面得到快速發展,尤其是微流控型生物傳感器備受關注。基于發光細菌的微流控型生物傳感器中,細菌所處狀態有多種形式[14],包括處于液體中的懸浮態(圖1A)、被制作成凍干粉的凍干態(圖1B)和固定在一次性樣品池、光纖或生物芯片上的固定態(圖1C),其中常用的是懸浮態和固定態。

3. 1搖細菌固定型微流控生物傳感器

細菌固定型微流控生物傳感器根據細菌固定方式的不同可分為藻酸鈣固定、瓊脂固定以及海藻酸鈉薄片固定等,以下分別對上述幾種固定方式的生物傳感器進行介紹。

Eltzov等[18]研發了一種檢測水中有毒污染物的在線光纖監測系統。將分別攜帶recA(DNA損傷)和grpE(熱休克)啟動因子的兩株細菌懸浮液與2%海藻酸鈉溶液按體積比1:1混合均勻后,涂布在光纖頭部,隨后涂布0.5mol/LCaCl2溶液,使其反應形成藻酸鈣,將細菌固定在光纖頭部。作者首先對系統連續運行24h所需的條件進行優化,并在流動狀態下檢測自來水和地表水中的污染物。初步實驗表明,添加7.5%的LB培養基是保證設備在流動水體中長時間(>1h)運行的必要條件。在對自來水的水質監測中,該系統能夠穩定運行24h,但在地表河流的水質監測中,由于流體不斷沖擊光纖頭部,使其固定的發光細菌逐漸減少,系統在運行20h后很難對污染物繼續產生響應。隨后,作者對該系統進行深入優化[20],首先調整培養基成分和濃度,然后通過在流體出口增加蠕動泵的方式研究不同流速對測試結果的影響,并為光纖探針增設水流緩沖保護罩以降低流體剪切力,優化后的裝置如圖2所示。優化后的監測系統不僅能快速檢測到水質變化,而且將最大流速從3L/h提高到10L/h,在相同的時間內完成了更大體積量的水樣檢測。同時,該設備實現了對流動水體中的污染物毒性的實時監測,可為水源地取水口或飲用水管網等重要節點的水質安全提供早期預警功能。

圖1基于發光細菌的生物傳感器:(A)細菌懸浮型生物傳感器[15];(B)凍干細菌型生物傳感器[16];(C)細菌固定型生物傳感器,(1)細菌固定在一次性樣品池中[17],(2)細菌固定在光纖上[18],(3)細菌固定在生物芯片中[19],(a)加工好的微型細胞芯片照片,(b)芯片通道及細菌固定區的微觀示意圖Fig.1Threekindsofbiosensorsbasedonluminescentbacteria:(A)Biosensorwithbacteriainsuspension[15],(B)Biosensorwithfreeze-driedbacteria[16]and(C)Biosensorwithimmobilizedbacteria.(1)Immobi-lizationofbacteriainadisposablecard[17];(2)Immobilizationofbacteriaontoopticalfibertips[18];(3)Immobilizationofbacteriainthebiochips[19];(a)thephotographofthefabricatedmicro-well-chip,(b)themicroscopicviewofthechannelandtheregionwherethebacteriaisimmobilized

Jouanneau等[17]設計了兩種基于發光細菌不同保存方式(圖3A)的生物傳感器(“Lumisens芋冶和“Lumisens郁冶),用于在線檢測環境樣品中的重金屬。其中,Lumisens芋系統中的細菌懸浮液與4%的瓊脂糖溶液混勻后,固定在有連續流驅動的微井中,生物活性較高;而Lumisens郁系統中使用的細菌在96孔微板中進行冷凍干燥,活性相對較低。兩套系統均封閉于暗箱中,利用CCD相機對細菌發出的光信號進行圖像捕捉并記錄。在10d內,作者分別利用兩種生物傳感器連續檢測蒸餾水或環境樣品中的汞(Hg),每天將系統中的發光細菌暴露于含有500nmol/LHg的樣品中100min,其余時間持續通入細菌培養液。結果表明,Lumisens芋系統自啟動6h后產生響應信號(圖3B),在測試的10d內生物發光水平不穩定,變化率達40%,固定化細菌在第3~6d處于穩定生長階段,生物發光信號的重現性和重復性接近5%。Lumisens郁系統啟動1.5h后便可獲得響應信號,生物發光信號的重現性達3%,在10d內可達到Hg的穩定檢測;在Lumisens芋系統中,細菌易受到暴露的污染物的影響,導致后續實驗中的細菌活性降低,影響實驗結果的一致性;在Lumisens郁系統中,細菌被限定在微孔板中的各個微孔中,執行獨立地單次分析,但操作相對繁瑣,重復性較低。

圖2優化后的水體污染物毒性檢測傳感器[20](A)系統優化后的示意圖;(B)流通室照片;(C)六層藻酸鈣聚合形成的光纖探針Fig.2Biosensorfordetectingwatertoxicityafteroptimization[20](A)Schematicoftheoptimizedbiosensor,(B)Photoofperspexflowunitand(C)Calcium(2%,V/V)-polymerizedalginatewithsixlayersformingthefiberopticprobe

圖3重金屬在線檢測生物傳感器[17](A)Lumisens芋和Lumisens郁兩種系統中的流體通路示意圖;(B)Lumisens芋系統每天暴露于500nmol/L的汞生物發光實時監測數據,(a)實驗室條件下的兩次測試結果對比,(b)微井中的細胞生長曲線(CFU=菌落單位),(c)CCD相機拍攝的樣品池中固定化細菌的發光照片Fig.3Biosensorforonlinedetectionofmetals[17](A)fluidicchartofthetwosystemsLumisens-andLumisens-and(B)real-timemonitoringdataofLumisens-whenexposedtoHg(500nmol/L)daily.(a)Comparisonoftheresultsbetweentwiceexperiments;(b)Growthcurvesofcells(CFU=colonyformingunit);(c)CCDcameraimagingoftheimmobilizedbacteriainmulti-wellcard

Elad等[21]開發了一種在線連續監測水質毒性的流通式生物傳感器。瓊脂固定化重組發光細菌的模塊化生物芯片是該裝置的核心部分,單光子雪崩二極管探測器(SPAD)為響應信號探測裝置(圖4A)。作者配備了誘導型和組成型兩種菌株,并在連續的水流中持續放置10d,這段時間里分別連續通入萘啶酸、百草枯、As髥和上述3種物質的混合液以及一個工業廢水水樣2h。通過比較固定態和懸浮態下細菌對同種濃度污染物的響應強度,發現懸浮態的細菌對污染物的靈敏度更高,但穩定性略低于固定態,且重復性接近20%。該傳感器對6和0.01mg/L的As髥以及0.02和0.005mg/L的Sb髥(圖4B)具有很好的識別作用,且檢測濃度滿足美國和歐盟飲用水水質安全標準的檢出限要求。該生物傳感器能夠在0.5~2.5h內檢測到所有的模擬污染事件,并根據污染性質反饋特定的響應信號,可用于防止有毒化學品意外泄露或水源地有毒物質故意投放等預警系統,并與相關物化方法互補,構成水質安全保障網絡。

圖4流通式生物傳感器示意圖及響應曲線[21](A)流通室頂視圖,單光子雪崩光電二極管、步進軸、流通室的橫斷面;每個流通室都是三層結構,由玻璃、PDMS和PMMA組合而成,形成一個含有12個微井的通道;(B)砷和銻的響應曲線Fig.4-Schematicofflow-throughbiosensor[21](A)Topviewoftheflow-throughchambers,thesinglephotonadvanceddiode(SPAD)detectors,thestepperaxis,across-sectionofaflow-throughchamber.Eachflow-throughchamberisconstructedofthreelayers(glass,PDMSandPMMA),whichformsaflowchannelwith12wellsinitspath;(B)ResponsecurvesofAsandSb

近年來,基于發光細菌的生物傳感器對于水質毒性檢測的研究較多,用于氣體毒性檢測的相關報道較少。Eltzov等[22]設計的空氣毒性檢測傳感器在室內空氣毒性監測方面表現優異,該系統的核心部分主要包括:(1)光電倍增管,用于檢測細菌的響應;(2)液體光導管,用于光信號傳輸;(3)海藻酸鈉薄片,用于固定細菌。傳感器示意圖如圖5所示。作者將grpE啟動因子改造后的大腸桿菌培養液與過濾滅菌的2%(w/V)低粘度海藻酸鈉溶液以體積比1頤1混合,在直徑為0.6mm的圓柱體中滴入0.5mmol/LCaCl2溶液30滋L及海藻酸鈉與發光細菌的混合液50滋L,制成固定薄片。作者首先對細菌固定薄片進行優化,將細菌固定薄片放入20mL管中并在其附近滴加1滋L氯仿,通過研究細菌固定薄片的不同朝向位置、環境溫度以及暴露時間對傳感器靈敏度的影響,發現正面朝向可以提高化學物質擴散到基質中的擴散速率,表明升高環境溫度或延長暴露時間可以提高細胞的響應強度。隨后,研究人員

在一間辦公室里放入集成好的裝置,將幾種空氣中常見的污染物,如香煙的煙霧、丙酮和油漆(含有三氯甲烷)等釋放進房間,記錄生物傳感器對各種污染物的響應程度。研究表明,生物傳感器對幾種污染物的響應結果顯示了其對室內環境中有毒物質的響應能力,其中對丙酮的響應最為強烈,對油漆中的三氯甲烷次之。

雖然生物傳感器和傳統的分析方法都能夠定性分析空氣樣品中的污染物類型,但傳統方法仍然存在價格昂貴、需要特殊的實驗室設備以及不適于實時監測等問題,且所需操作人員技術要求嚴格是阻礙傳統方法在毒性監測中廣泛應用的最大問題。與之相反,生物傳感器操作簡單、靈敏便捷,對構建新型空氣質量監測裝置具有重要的指導意義。

圖5空氣毒性檢測傳感器示意圖及其對丙酮和三氯甲烷的檢測結果[22]:(A)傳感器示意圖;(B)傳感器對丙酮和三氯甲烷的響應曲線,(1)傳感器對辦公室釋放2mL丙酮時的響應,(2)傳感器對辦公室釋放5和10mL三氯甲烷的響應

Fig.5Biosensorfordetectingairtoxicity[22]:(A)Schemeofthebiosensorand(B)responsecurvesofthebiosensorexposedtoacetoneandchloroform.(1)Responseofthebiosensortothe“spillingaccidents冶of2mLofacetoneinofficeroom;(2)Responseofthebiosensortothe“spillingaccidents冶of5and10mLofchloroforminofficeroom

細菌固定化雖然可以限制細菌向周圍環境中擴散,且可以在污染物移除后繼續重復利用某些生物元素,提高生物傳感器的使用壽命。但這種方法在原位應用中存在一些問題,如固定的細菌會隨著時間的推移發生變化,影響對污染物的響應;由于細菌的擴散和游動受到限制,使其與污染物的接觸不夠充分,從而導致實際應用過程中的檢測信號較低;用于固定細菌的一次性芯片需要頻繁更換,因而在快速檢測大量污染物時消耗量較大。因此,對于短時間內的連續快速檢測而言,懸浮型的生物傳感器更具優勢。

3.2細菌懸浮型微流控生物傳感器

1996年,Gu等[23]最先制作出一種用于測試細胞對有毒物質響應的連續流微型生物反應器,該微型反應器類似一個沒有探針控制的簡化生物培養反應器。在連續流的培養狀態下,重組生物發光大腸桿菌可以保持最佳的生理狀態。這種微型生物反應器的容積約58mL,可以長期連續操作,具有較高的穩定性和可靠性。作者研究了在連續流狀態下重組生物發光大腸桿菌對乙醇的響應,發現連續培養的細菌發光水平取決于菌液的最終稀釋倍數。高稀釋倍率下的發光細菌處于非常活躍的代謝狀態,對環境的刺激響應較為迅速,菌液的稀釋倍數越高,反應器的靈敏度越高,響應越快。1999年,多通道形式的微型反應器得以進一步開發制作,其主要包括兩個反應器:一個用于維持細菌處于穩定狀態,并向另一個反應器持續供應新鮮細菌;另一個用于發光細菌與待測物質的接觸混合,完成檢測分析[24]。但是由于該系統細菌未被固定,因此無法保證檢測的穩定性。

2003年,Thouand等[25]開發了一種基于三甲基錫誘導發光的基因工程發光細菌生物傳感器。細菌在一個容積約100mL的專用生物反應器中培養,反應器頂部設有培養基和待測物質的出入口,并插入傳感器實時測量反應器內的pH值、溫度、溶解氧和細胞密度,實時監測反應器內細菌的生長狀態。為了篩選用于傳感器的最佳培養基,作者分別利用肉湯培養基和葡萄糖培養基培養細菌,在培養進入指數期后,均加入0.001~10.0滋mol/L三甲基錫進行誘導。結果表明,采用葡萄糖培養基,且三甲基錫達到1.5滋mol/L時,細菌的發光最強,隨著樣品濃度增加,毒性增大,發光強度降低;在采用肉湯培養基過程中,三甲基錫濃度為10滋mol/L時,發光強度最大,并且其發光強度只有前者的1/4。該系統主要特點在于:(1)光纖被固定于反應器蓋子上,不與細菌和樣品接觸,避免了生物膜形成可能導致的光輸出損失;(2)引入多個微探針以評估細菌連續生長過程中的活性;(3)設備具有自動化、集成化、便攜等優點。但該生物傳感器檢測時間較長,通量低。

Zhao等[26]研發了一種基于發光細菌的飲用水中毒物檢測的微流控裝置,該裝置以費氏弧菌為受試生物,監測水中潛在的重金屬離子和苯酚等細胞毒性物質,且配有獨立的細菌連續培養系統。如圖6所示,其芯片包括兩個逆流混合器和一個T型液滴生成器,以及6個螺旋微通道,此設計可實現系統的連續檢測。將細胞懸浮液和水樣引入微混合器中充分混合,隨后分散到氣流中生成氣包水液滴,保證傳感器內的發光細菌可以獲得充足的養分供應。作者選擇Cu2+、Zn2+、重鉻酸鉀以及3,5鄄二氯苯酚作為典型毒物進行測試,以驗證系統靈敏度。在測試過程中,Zn2+的濃度與相對發光單位之間存在非線性關系。初步測試表明,該系統只能對水中簡單有毒化學物質的濃度進行粗略估計,不能識別或量化特定污染物,但可在大量待測樣品中快速篩選有毒物質,其作為一種有效的急性毒性毒物篩選工具,具有良好的應用前景。

圖6水質檢測系統示意圖[26]:(A)液滴流由LOC芯片生成,并流動到觀察室,PMT在觀察室頂部收集發光信號;(B)觀察室的動態圖,液滴從LOC芯片中不斷流入觀察室,在短時間內,觀察室內的緩沖液被細菌和污染物的混合液完全取代,每隔一段時間對觀察室的發光信號進行檢測Fig.6Schematicofwaterqualitydetectionsystem[26]:(A)Thedropletflowisgeneratedbycell-basedLOCandmovedintoobservationchamber,PMTislocatedontopoftheobservationchamber;(B)Dynamicdiagramofobservationchamber,thedropletsflowfromcell-basedLOCthroughobservationchambercontinuously,thebufferwillbereplacedbythemixtureofbacteriacellsandcontaminantswithinashortperiod

4基因操控以提高發光細菌生物傳感器性能

重組的發光細菌是通過向宿主細胞插入或轉染攜帶啟動子和目的基因(lux基因)的質粒構建而成。啟動子負責特異性識別,目的基因指導氧化熒光素酶的合成,使重組細菌具有發光性能[27]。啟動子是位于編碼基因前端的非編碼DNA序列,在RNA聚合酶識別后其下游基因的轉錄得以啟動。因此,為提高發光細菌生物傳感器的整體分析性能,研究人員通常對啟動子區域進行分子改造。

根據待測物質的性質,研究人員已經構建了大量含有不同啟動子的工程菌株。不同來源的生物發光基因在導入細菌過程中都必須考慮其具體特性,例如,在費氏弧菌的發光基因植入大腸桿菌的過程中,費氏弧菌中熒光素酶保持活性所需溫度低于大腸桿菌(37益)。而研究發現,明亮發光桿菌則與大腸桿菌保持活性所需溫度一致,因此研究人員將其發光基因轉染到大腸桿菌中,進而獲得了更短的響應時間[28,29]。Yagur鄄Kroll等[30]提出了4種通過操控啟動子來增強發光細菌生物傳感器性能的方法:(1)修改包含啟動子區域的DNA片段的長度;(2)通過定向進化過程引入一個隨機基因突變體;(3)在啟動子序列中引入更多特定的位點突變體;(4)復制啟動子序列,以增加RNA聚合酶的結合位點。通過這四種方法,可顯著提高生物傳感器的靈敏度、響應時間以及發射光強度。

發光細菌含有使其發光的lux操縱子luxCDABEG,其中,luxA和luxB基因分別負責細菌熒光素酶中的琢亞基和茁亞基的編碼,而luxC、luxD、luxE基因則負責脂肪酸還原酶中r、s、t多肽的編碼,luxG負責黃素還原酶的基因編碼[31]。從不同種類發光細菌中分離出的lux基因種類與數量并不完全相同,但以上提到的6個基因中,luxC、luxD、luxA、luxB和luxE存在于已發現的所有發光細菌中,其中luxG基因在發光桿菌屬的lux操縱子中沒有發現。到目前為止,發光細菌的lux基因常被用于制造重組細菌來進行生物測試,從而提高生物發光強度,降低檢測限,并且縮短響應時間。

細菌中lux基因受上游啟動子序列的調控,因此,提高生物發光性能除了可以對啟動子區域進行分子調控外,還可以通過拆分lux基因來實現[32]。luxCDABE可分成兩個較小的基因片段,即luxAB和luxCDE,前者負責熒光素酶的編碼,后者負責指導合成生物發光反應所需要的長鏈脂肪醛。對這兩個基因片段進行修飾,使其處于誘導型應激反應啟動子或合成的組成型啟動子的控制下。研究人員通過對誘導型或組成型的luxAB與誘導型或組成型的luxCDE進行多種組合后,發現誘導型luxAB和組成型luxCDE是最佳組合方式,這種組合方式能夠增強細菌的發光強度,加快反應速度。

隨著基因工程技術逐漸成熟,將攜帶lux基因的質粒轉染到非發光細菌中的方法已被廣泛使用。研究人員可根據特定污染物選擇適合的細菌進行基因改造,獲得特異性重組的發光細菌,進而獲得更高靈敏度,更寬響應范圍的發光細菌生物傳感器。但是基因工程菌的生長環境、生長條件和規律是否變化,對污染物毒性檢測的靈敏度和穩定性是否有提高,以及需要何種條件的污染物誘導亟待進一步研究。因此,借助微流控技術的微腔室、微混合器與多種多樣的原位檢測技術帶來的微環境梯度形成與高通量等特點,將大大加快優化條件的篩選過程。

5結語

發光細菌法因其靈敏度高、反應速度快、操作簡便以及容易實現高通量檢測等特點在水質急性毒性檢測方面發揮著巨大作用,其與光纖技術、傳感技術以及微流控技術的結合可以靈活應對各種復雜的檢測環境。發光細菌毒性分析方法適用于快速篩選大量樣品,將其與其它分析方法相結合,可對樣品進行深度檢測以提供全面的風險評估結果。基于發光細菌的各類生物傳感器將在防止有毒化學物質故意或意外滲入到地表水或市政水網等系統的應用中發揮著重要作用,為環境安全提供保障。

分子生物學的發展有望使發光細菌針對特定污染物產生特異性響應,擴充發光細菌的應用范圍。將發光細菌與先進的材料、設備或技術(如微/納流體、先進的光學材料等)相結合以提高整個測試系統的效率,也將成為其發展的一個重要方向。此外,微通道內的高壓強與低溶解氧環境對發光細菌發光強度的影響仍然存在,微流控技術中微納氣泡的生成和操控將是解決這一問題的關鍵。

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