微納尺度物質(zhì)的分離和分選在精準醫(yī)學、材料科學和單細胞分析等研究中至關重要。精準、高效和快速的分離微納尺度物質(zhì)能夠為癌癥的早期診斷、生物樣品檢測和細胞篩選提供重要幫助,其中基于外加場分離技術的分離微納尺度物質(zhì)因可以對微納尺度物質(zhì)高效在線分離和分選,被廣泛應用于微納米顆粒、外泌體以及生物細胞的分離工作中,而目前多數(shù)外加場分離技術存在裝備繁瑣和樣品消耗大等問題。微流控技術是一種通過制作微通道和微流控芯片操縱微小流體對微納尺度樣品組分進行分離的技術,因具有快速檢測、高通量、在線分離、集成性高、成本低等優(yōu)勢現(xiàn)被應用于微納尺度物質(zhì)分離分析中,是一種微納尺度物質(zhì)分離的有效方法,通過在微流控芯片上設計不同的通道及外部配件提高主動場對微納尺度物質(zhì)分離效率。外加場分離技術與微流控技術聯(lián)用可以實現(xiàn)微納尺度物質(zhì)的無損、高效、在線分離。該綜述主要概述了近年來在微流控芯片上依托流動場、電場、磁場及聲場等外加場分離技術來提高對微納尺度物質(zhì)分離效率的研究現(xiàn)狀,并將各個外力場對單細胞、微顆粒等微納尺度物質(zhì)的分離進行分類介紹,總結(jié)各自的優(yōu)缺點及發(fā)展應用,最后展望了外加場分離技術與微流控技術聯(lián)用在應用于癌細胞的早期篩查、精確分離微尺度物質(zhì)領域的未來發(fā)展前景,并提出聯(lián)用技術的優(yōu)勢和未來應用等。

微納尺度物質(zhì)的分離分選在生命科學、材料科學和環(huán)境科學等領域中至關重要,分離微納尺度物質(zhì)將在靶標篩查、個體化差異、新藥開發(fā)、個體化精準治療等方面具有巨大意義。目前,主要根據(jù)微納尺度物質(zhì)表面的物理化學性質(zhì)如尺寸、形狀、電荷、質(zhì)量等不同對其進行分離分選。現(xiàn)有的分離微納尺度物質(zhì)方法可以分為兩大主流。一種是基于目標物尺寸差異在通道和流體的共同作用下的路徑不同,從而實現(xiàn)分離的被動式分離技術,如確定性側(cè)向位移、慣性聚焦、超濾法、離心法等。雖然被動式分離技術取得了一定進展,但其普遍存在分離度低、易堵塞通道、難以實現(xiàn)在線分離檢測的問題。第二種分離方法是根據(jù)混合目標物中不同目標物所具有的物理化學性質(zhì)不同,通過添加不同的外力場使目標物在分離系統(tǒng)內(nèi)部的運動行為發(fā)生改變,從而實現(xiàn)分離的主動式分離技術,外加力場類型有電場、磁場、流場及聲場等,這些主動式分離技術可以實現(xiàn)對微納尺度物質(zhì)的在線分離和分選,并且在微顆粒、外泌體、病毒及單細胞分離工作中展現(xiàn)出重要的作用。然而如何使這些分離技術小型化、集成化、易操作仍然是現(xiàn)今待解決的問題。

微流控技術也被稱為芯片實驗室,起源于1990年Manz等提出的“微全分析系統(tǒng)”,指的是通過制作微管道或微流控芯片來操縱微小流體并對微尺度物質(zhì)樣品組分進行分離的技術,是一種主要針對微納尺度物質(zhì)分離的有效方法。微流控技術實現(xiàn)了對微納尺度物質(zhì)的精準、高通量、在線分離,可以用最少的試劑、時間和成本完成分離任務且具有微型化、集成化、成本低廉、高通量等特征。隨著微流控技術的發(fā)展,利用微納尺度物質(zhì)的不同性質(zhì),制作特殊結(jié)構的微流控芯片裝置,以提高對微納尺度物質(zhì)的分離效率,更具有針對性,微流控芯片的生物相容性提高了其在生物細胞操作和分析中的應用,同時在微流控技術方面可以使復雜分析方案合理化,顯著減少樣品體積和試劑成本,在處理微量樣品時具有降低成本、降低危害、提高分辨率等優(yōu)勢。隨著微流控技術對微納尺度物質(zhì)分離發(fā)展的不斷增長與進步,針對細胞、顆粒物等微納尺度物質(zhì)的分離在醫(yī)療領域、生物化學領域等起到了至關重要的作用。利用這些優(yōu)勢可以將基于外加場的分離技術與微流控技術進行聯(lián)用,制備所需的微流控芯片,針對不同特性的樣品施加外部力場,比如電場、磁場及聲場等來對混合樣品組分進行精準分離。

本文主要概述了在微流控芯片上依托流動場、電場、磁場及聲場的主動分離技術來提高分離效率的研究現(xiàn)狀,并探討對生物細胞的富集與混合顆粒物的有效精準分離的發(fā)展與應用。

1 流場場流分離技術

流場場流分離技術是各種場流分離技術中使用最通用的一種技術,其中非對稱流場流分離技術是1987年由Wahlund和Giddings提出的一種流場分餾技術,目前被廣泛應用。該技術將非特異性的相互作用減少到最低限度,并具有分辨率高的優(yōu)點,在FIFFF通道內(nèi),外加力場為垂直于流道方向的橫向流,樣品在橫向流的驅(qū)動下與自身擴散力之間達到一個平衡,各組分在通道內(nèi)壁上產(chǎn)生分布差異,其中,小尺寸樣品在積聚壁上形成的分布層要高于大尺寸顆粒,這時流動場在通道內(nèi)流動時,分布層較高的小尺寸顆粒要比大尺寸顆粒更早的洗脫,從而實現(xiàn)分離。FIFFF沒有固定相,對樣品施加的剪切力和機械應力較小,使它成為一種溫和的分離技術,現(xiàn)已廣泛應用于分離和表征不同尺寸和不同形狀的顆粒、細胞、蛋白質(zhì)或DNA等物質(zhì)。

Dou等利用非對稱流場流分離技術在線耦合紫外、多角度光散射和熒光探測器對蛋黃血漿進行分離和表征。利用蛋黃血漿作為AF4的載體液,評價了AF4對蛋黃血漿中的可溶性蛋白、低密度脂蛋白及其聚集物進行高效快速分離和表征的實用性。同時研究了低密度脂蛋白在卵黃血漿中的聚集行為,利用程序交叉流的AF4具有提高檢測能力、降低樣品消耗和減少分析時間等優(yōu)點。結(jié)果證明,AF4適用于尺寸分布范圍較大目標物的分離和表征,如蛋黃血漿。該團隊還利用AF4結(jié)合多角度光散射和差分折射探測器對淀粉的分離和表征進行了深入研究,為今后更好地研究淀粉結(jié)構-功能的關系提供重要信息。

Ashby等利用流場場流分離技術結(jié)合離心分離技術,建立了一種基于相對解離率的冠狀蛋白鑒定方法,用來篩選納米顆粒和蛋白質(zhì)之間的相互作用。該方法將超順磁氧化鐵納米顆粒和免疫球蛋白G(lgG)在人血清中進行孵育,再利用F4和離心法分離出與SPION親和力較好的蛋白質(zhì),F4以較快的速度洗去與納米顆粒相互作用的蛋白質(zhì),解決了當納米粒子進入到生物基質(zhì)時,基質(zhì)表面形成的蛋白冠對納米粒子在生物系統(tǒng)中的后續(xù)行為影響,有助于研究蛋白質(zhì)冠的時間分布及其在生物基質(zhì)中的演化,以及高通量分析蛋白質(zhì)冠與粒子特性相關的動態(tài)特征。

Adkins等將納米顆粒跟蹤技術與AF4耦合得到AF4-NTA技術,彌補了NTA在線檢測器存在檢測范圍窄、流量小和壓力閾值低等問題。AF4-NTA作為一項對混合物中不同粒子數(shù)的納米材料進行高效精確粒子計數(shù)的技術,利用合理的分流設計,對尺寸為50、100和200 nm的聚苯乙烯混合物進行分離分析,同時在線對混合物中不同納米尺寸目標物進行精確地顆粒計數(shù)。

目前,AF4在不斷地進步與發(fā)展,無論在化學分離領域或者生命科學等其他重要領域都顯示出了巨大的潛力,它可以利用溫和分離且裝置結(jié)構簡單等特性,與不同的檢測器進行耦合,為生物治療和納米顆粒分離表征提供技術支持。在未來,AF4溫和分離特性優(yōu)勢與微流控的通道小型化、節(jié)約試劑和節(jié)約樣品成本的優(yōu)勢相結(jié)合,成為一種高度靈活和具備高分辨率的分離技術,具有巨大的發(fā)展前景。

2 基于外加電場的分離技術

近年來,越來越多的科學家利用電場對微納尺度物質(zhì)進行分離分析。主要分離原理是根據(jù)目標物尺寸、大小和帶電荷量等特性的不同,通過調(diào)節(jié)電參數(shù)使其在分離系統(tǒng)內(nèi)的運動行為發(fā)生變化,達到對生物細胞和顆粒物等微納尺度物質(zhì)的操縱與分離。常見的外加電場的分離方法分為4種(見圖1),分別為毛細管電泳、介電泳、電場場流分離、電滲驅(qū)動。

圖1   目前被廣泛使用的4種電場分離技術

2.1 毛細管電泳

根據(jù)在一定的電場作用下帶電粒子在介質(zhì)中定向遷移的性質(zhì),利用毛細管電泳技術在兩端施加高壓電場對微納尺度物質(zhì)的分離分析滿足當今高效快速的分離需求。毛細管內(nèi)壁與緩沖溶液的界面上形成雙電層,在高壓電場的驅(qū)動下形成定向運動的電滲流。如圖1a所示,帶電粒子根據(jù)自身的電泳力和電滲流力差異實現(xiàn)分離。毛細管電泳具有分析快速靈敏、樣品消耗量少、分離效率高等優(yōu)點,在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測中應用廣泛。將毛細管電泳技術與微流控技術聯(lián)用,即微流控芯片電泳是近年被廣泛應用的一種新型分離技術,具有低成本、分辨率高、快速等優(yōu)點,被廣泛用于微納尺度物質(zhì)的分離分析中。Zhang等利用微流控芯片電泳技術對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌3種細菌進行定量檢測,有助于對人工污染的生食肉類中的致病菌進行分析,結(jié)果顯示MCE技術具有靈敏度高、速度快、試劑消耗少和操作迅速等優(yōu)點,是一種有效、可靠的食品安全評價方法。

Jeon等開發(fā)了一種基于壓力驅(qū)動流誘導電泳的連續(xù)分離方法,如圖2a所示,在微流控裝置內(nèi),混合的微納尺度物質(zhì)受到來自流體的驅(qū)動力、電滲流帶來的阻力和電泳力為主導的3種合力,根據(jù)其自身受電場影響下的電泳遷移率不同而進行有效分離,分離效率可達97%。

蔡綺丹等為了驗證阿霉素這一常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物是否與谷胱甘肽存在結(jié)合,利用微流控芯片電泳技術微型化集成化等優(yōu)點。如圖2b所示,利用簡化的Hummel-Dreyer芯片毛細管電泳法,考察了阿霉素與還原性、氧化型谷胱甘肽的親和作用,最終得到了谷胱甘肽自身與阿霉素無親和作用這一結(jié)論,為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了理論支持。綜上所述,毛細管電泳技術與微流控技術的聯(lián)用在醫(yī)療、食品和生物等各個領域都有很大的發(fā)展前景。

圖2   基于微流控芯片電泳的分離系統(tǒng)

毛細管電泳技術與微流控技術的聯(lián)用同時具備毛細管電泳技術無標記和對細胞等無損傷的優(yōu)勢,聯(lián)用微流控技術的高效、微型化精準分離,解決了傳統(tǒng)毛細管電泳技術裝置繁瑣等問題,具有廣闊的應用前景。

2.2 介電泳

介電泳由Pohl在20世紀50年代首次研究提出,指可極化粒子在非勻強電場中將會受到極化作用進而產(chǎn)生偶極矩,偶極矩與非勻強電場之間產(chǎn)生介電泳力。粒子在該體系內(nèi)將會受到指向場最大的力正介電泳力,或者遠離場的最大力負介電泳力,如圖1b所示。介電泳操縱粒子具有集成化、操作方便、成本低廉等優(yōu)勢,已廣泛用于分離微顆粒和細胞。但是介電泳如果在強電場條件下對生物樣品進行分離,則會導致生物樣品在電場內(nèi)受焦耳熱的影響直接死亡或產(chǎn)生不可逆的損傷。因此,利用微流控裝置產(chǎn)熱少、高通量和成本低等優(yōu)勢,將介電泳技術與微流控技術聯(lián)用,可以實現(xiàn)對生物樣品無損和高效的分離。

為了解決多組分樣品的同時富集,Zhao等研制了一種新型微流控裝置,在直流介電泳提供的非勻強電場條件下,調(diào)節(jié)外加電場的電參數(shù)和流動相懸浮液的電導率,實現(xiàn)對大小相近但介電特性不同的微納米混合顆粒物的分離。

Zhao等還制作了新型交流介電泳微流控芯片,芯片同時將兩個電極嵌在相對側(cè)壁上的一組不對稱孔內(nèi),使產(chǎn)生不均勻的電場。如圖3a所示,生物細胞等樣品通過微流控裝置內(nèi)時,利用液聚焦使樣品在同一水平線移動,聚焦后的樣品進入到DEP電場范圍內(nèi)時,樣品受pDEP和nDEP的影響分別向兩側(cè)孔內(nèi)移動。該實驗研究了活酵母細胞和死酵母細胞在不同離子濃度、電導率、交流電場頻率下的DEP行為。與直流介電泳不同的是,該裝置利用調(diào)節(jié)交流電頻率、電壓等參數(shù),成功分離大小相近但介電常數(shù)不同的活酵母細胞和死酵母細胞。該微流控裝置制作簡單,設計可以避免焦耳熱效應,且能誘導非均勻電場產(chǎn)生強梯度,可用于分離尺寸相近的納米顆粒。

圖3   基于介電泳技術的微流控分離系統(tǒng)

Kim等使用獨特的合成介電泳標記來明確多種細胞類型,在微流控裝置的內(nèi)部通道結(jié)構上放置兩個具有不同角度的傾斜電極,利用傾斜電極提供非均勻電場,如圖3b所示。在非勻強電場下,混合樣品中不同尺寸的顆粒物在裝置內(nèi)產(chǎn)生的運動行為不同,實現(xiàn)了高分辨率和高吞吐量的分離效果。

Khoshmanesh等設計了一種非黏附的脂質(zhì)捕獲DEP系統(tǒng),如圖3c所示,利用光刻技術在玻璃基板上制備了DEP微電極陣列,避免了生物細胞的污染。基于芯片的陣列應用于捕獲人白血病細胞的環(huán)境掃描電子顯微鏡分析。這項工作驗證了DEP細胞保留和捕獲技術。利用DEP芯片對人白血病細胞進行捕獲,同時在ESEM上對單個非貼壁細胞進行高分辨率分析,達到了造血腫瘤和干細胞的水動力捕獲和長期動態(tài)分析。

Sun等開發(fā)了一個具有自組裝液體電極的新型DEP微流控裝置,如圖3d所示。利用室溫離子液體形成的液體電極與DEP緩沖溶液耦合,再利用外部電場所施加的電壓,提高微流控芯片內(nèi)的電導率,產(chǎn)生電場梯度以對芯片內(nèi)的細胞與粒子進行高效分離,利用自組裝的液體電極DEP微流控裝置成功分離聚苯乙烯珠與PC-3細胞、存活與凋亡的PC-3細胞以及人脂肪干細胞與MDA-MB-231癌細胞。該裝置具有成本低、分離效率高等優(yōu)點,在細胞分離實驗中具有巨大潛力。

Khamenehfar等利用介電泳對液體介質(zhì)中懸浮的可極化粒子具有可操縱性的特點,制作了一種利用介電泳芯片的裝置,如圖3e所示。在微流控芯片通道內(nèi)部填充藍色使用染料,從左側(cè)的入口將細胞樣品注入,中間儲層用來藥物輸送,在電極產(chǎn)生的介電泳力作用下對骨髓性白細胞進行捕獲。利用介電泳芯片裝置對單細胞分析,檢測多藥耐藥的藥物流出功能中單細胞的異質(zhì)性,并捕獲了具有MDR活性的白血病細胞和無MDR活性的白血病細胞,將其與良性白細胞區(qū)分。這對未來的醫(yī)療試驗研究提供了一個確定單細胞水平上MDR抑制的異質(zhì)性新技術。

綜上所述,介電泳技術由于對尺寸相近且節(jié)點特性相差較小的微納尺度物質(zhì)分離不具有高分辨率,且傳統(tǒng)介電泳裝置存在高電壓條件下易對生物細胞造成損傷,同時有效電場較小,因此可將介電泳技術與微流控技術進行聯(lián)用,利用微流控技術裝置的小型化設計,在低電壓條件下產(chǎn)生較高的有效電場,對帶有不同尺寸、不同介電特性的混合樣品進行精準分離。

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